萝卜硫素对大鼠局灶性脑缺血·再灌注损伤的神经元保护机制

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【摘要】目的研究萝卜硫素（SFN）对大鼠局部脑缺血-再灌注损伤的神经保护机制。方法24只雄性SD大鼠，随机（随机数字法）分为3组，A组：假手术组（n=8），B组：缺血-再灌注模型组（n=8），C组：萝卜硫素干预组（n=8）；A组：假手术后腹腔注射等量磷酸盐缓冲液（PBS），B组：缺血-再灌注术后腹腔注射等量PBS，C组：缺血-再灌注术后腹腔注射萝卜硫5 mg/kg。通过四氮唑红（2，3，5-Triphenyltetrazolium chloride，TTC）染色测定脑梗死体积，苏木精伊红染色法（HE）观察组织学形态改变，TUNEL 法检测脑神经元凋亡变化，RT-PCR 测定缺血脑组织核转录因子kappa B亚单位p65（NF-κBp65）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）mRNA的表达，免疫蛋白印记法（Western-bloting）检测脑组织iNOS、NF-κBp蛋白表达水平。结果与B组比，C组脑梗死体积降低 [（96.34±3.72） vs. （124.65±3.85），P

【关键词】萝卜硫素；缺血-再灌注；损伤；神经元；凋亡；TUNEL；核转录因子κB；诱导型一氧化氮合酶

Protective effects of sulforaphen on neuronal apoptosis after focal cerebral ischemia reperfusion injury in rats ZENG Wei-xian，CHEN Da-qing，GONG Yu-qiang，SUN Lai-fang，LU Zhong-qiu. Department of Emergency Medicine，The Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College，Wenzhou 325000，China

Corresponding author：CHEN Da-qing， Email：

【Abstract】ObjectiveTo investigate the protective effects of sulforaphen （SFN） on focal cerebral ischemia/reperfusion injury （IRI） in rats in order to explore the mechanisms. MethodsTwenty-four male SD rats were randomly（random number） divided into Sham-operated group （A group， n=8）， IRI group （B group， n=12）， sulforaphen group （C group， n=8）. SD rats were made to be transient focal cerebral IRI models. SFN 5 mg/kg was injected intraperitoneally to rats 15 minutes after IRI in C group， and rats of group A and group B received equal volume PBS instead. Infarct volume was measured by TTC staining and morphologic changes were observed with HE staining. Neuronal cell apoptosis index was detected by terminal deoxynucleotidyl transferase （TdT）-mediated dUTP-biotin nick end labeling （TUNEL） assay. Rats were sacrificed at 24 h after IRI. The protein levels of NF-κB p65 and iNOS were detected by using western bloting and the mRNA expressions of NF-κB p65 and iNOS were detected by using RT-PCR.ResultsCompared with the group B， infarct volume was significantly smaller in group C， the number of neuronal cell apoptosis in brain tissue were decreased significantly in group C [（96.34±3.72） vs. （124.65±3.85），P

【Key words】Sulforaphen；Ischemia/reperfusion；Injury；Neuronal；Apoptosis；TUNEL；NF-κB；iNOS

研究发现在脑缺血时，通过激活核因子kappa B（nuclear factor-kappa B，NF-κB）上调诱导型一氧化氮合酶（induced nitric oxide synthase，iNOS）表达，促使一氧化氮（NO）的产生，导致神经细胞损伤[1]。因此寻找一个有效药物来抑制炎症介质的释放和延缓脑缺血-再灌注损伤时神经元细胞的凋亡具有重要意义。萝卜硫素（sulforaphen，SFN）是一种由葡萄糖莱菔子苷经黑芥子硫酸苷酶酶解或酸水解后产生的异硫代氰酸盐衍生物，研究表明SFN能够诱导抗氧化酶的产生，从而发挥抗炎症、抗氧化和去毒性的作用[2]。但有关SFN与缺血性卒中疾病对神经元细胞凋亡的研究，少有报道。本实验通过制作缺血-再灌注大鼠模型，研究SFN对缺血-再灌注脑组织NF-κBp65、iNOS表达和神经元细胞凋亡的影响，探讨SFN对脑神经保护作用。

1材料与方法

1.1材料

萝卜硫素（美国LKT Laboratorie S公司），TTC染色剂（美国Sigma 公司），iNOS（美国Cayman 公司），NF-κBp65抗体，羊抗鼠β-actin（ Santa Cruz公司），山羊抗鼠的二抗试剂（江苏碧云天试剂公司），Trizol 试剂盒（美国Gibco-BRL 公司）， NF-κBp、iNOS、β-actin引物（上海生工生物技术公司），Imagepro-plus 6软件（Imaging 公司），其他试剂均来自国产，所有检测均于温州医科大学附属第二医院科研中心实验平成。

1.2方法

1.2.1实验动物及分组24只SPF级雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，6～8 周龄，体质量（200±10）g，由温州医科大学动物实验中心提供，随机（随机数字法）分为3组，A组：假手术组（n=8），B组：缺血-再灌注模型组（n=8），C组：萝卜硫素干预组（n=8）；温度25℃左右饲养。

1.2.2模型复制①B组：参照何斌等[3]以及Zacharek等[4]制作缺血-再灌注模型改良模型。②A组：其余操作同B组，不插入线栓线。③C组：操作同B组，参考文献[5]萝卜硫素最佳用药剂量 （5 mg/kg）干预。为避免低温对脑组织缺血-再灌注产生的影响，各组大鼠术后用烤灯照射，保持直肠温度 37 ℃左右，至大鼠清醒。

1.2.3脑标本制备含3个方面。

1.2.3.1模型组SD大鼠麻醉后，颈部正中切开皮肤，游离出左侧颈总、颈内、颈外动脉，于近心端结扎颈外、颈总动脉后，夹闭颈内动脉。将线拴插入颈总动脉，2 h后拉出拴线实现再灌注，再灌注24 h 后，每组随机（随机数字法）抽取4只大鼠，麻醉后开胸，将导管经左心室插入主动脉，生理盐水快速冲洗、灌注，并固定2 h，断头取脑，视交叉前后行冠状切片，置于4%甲醛固定，以石蜡固定、HE 染色观察脑组织学变化。另4只大鼠，再灌注干预 24 h后断头取脑，分成5等分冠状脑片置于2%TTC溶液中，观察脑组织颜色。取左侧半球脑组织，并保存于-70 ℃冰箱中备用（左侧缺血组织），以便检测各项指标。Imagepro-plus 6.0软件图像进行分析处理，计算脑梗死体积百分比。考虑脑水肿的影响，矫正梗死体积百分比（%）= （矫正梗死体积/ 左侧脑体积）×100%[6]。

1.2.3.2动物模型标准①疼痛刺激后右侧肢体反应迟钝或甚至消失；②提尾悬拉后右上肢蜷缩屈曲；③向右侧转圈或跌倒；④出现右侧霍纳（Horner）综合征：右侧眼裂变小。

1.2.3.3TUNEL 法检测脑缺血-再灌注区神经元凋亡变化常规脱蜡至水，切片加入蛋白酶复合液消化，37 ℃加封闭液30 min， 37 ℃标本予TUNEL反应50μL混合液于暗湿盒中反应 60 min，H2O2 阻断内源性过氧化物酶，于 37 ℃再次以封闭液15 min，切片加入20 μL 转化剂 POD （ HRP标记的抗荧光素抗体），于湿盒内进行免疫反应， 扩大信号；镜控下，以DAB显色；苏木素复染 1 min，脱水，封片。以嗅周皮质区为观察区，随机（随机数字法）选取共5个不重复的200高倍镜视野，计数光镜 200 倍时的阳性细胞数，取其平均值。

1.2.4RT-PCR检测NF-κBp、iNOS表达取各组细胞依次加入Trizol、氯仿、异丙醇抽提总RNA， -70 ℃保存。引物序列：（1）NF-κBp65上游引物：5’-CCAGTCCTGTGCTTCTGCTCA-3’，下游引物：5’-CATGGTGAACACGTTCTTTGG-3’（ 产物片段长度为124 bp）；（2）GAPDH上游引物5’-TGTGCTGCTCGTGGATCGTA-3’，5’-AGTCTGTTG

AGATCGCAGGAG-3’（ 产物片段长度为238 bp），（3）iNOS上游引物：5’-CATGTCTTGTGCCTTGT

CTCA-3’，下游引物：5’-CAGTGTGAACGACTGTC

TTGG-3’（ 产物片段长度为206 bp）；（4）β-actin上游引物5’-ACAGGTCATCACATCGGCAAT-3’；下游引物：5’-AAAGAAGGGTGTAAAACGCT -3’（ 产物片段长度为402 bp）。分别以β-actin，GAPDH作为内参照，用Invitrogen公司的Trizol 试剂盒 ，提取各组RNA，70 ℃保存。按操作步骤逆转录合成cDNA。PCR循环条件为：94 ℃预变性5min，92 ℃变性30 s，退火温度NF-κBp/β-actin 58 ℃/60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，反应32个循环；72 ℃内充分延伸6 min，4 ℃终止反应，-20 ℃保存备用。2%琼脂糖中反应产物进行电泳，以β-actin为内参照，采用Quantity One软件分析扩增产物条带（A），mRNA 水平的半定量指标：A（NF-κBp）/A（GAPDH）；A（iNOS）/A（β-actin）。

1.2.5组织蛋白质提取以及Western blotting法检测蛋白表达将脑组织剪碎匀浆，裂解各组脑组织蛋白，变性后经12% SDS变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后，再转印至硝酸纤维膜；室温摇床封闭2 h，分别加入抗NF-κB p（1∶：500）、抗iNOS（1∶500）孵育4 ℃过夜，加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠二抗（1∶1000），室温摇床2 h，同时加入β-actin（1∶2000），室温摇床2 h，洗膜，增强发光检测试剂（试剂A∶试剂B=1∶1）反应发光，曝光，显影，定影。Gel pro凝胶软件分析系统分析NF-κB p65蛋白、iNOS蛋白和内参 β-actin 累积光密度值。

1.3统计学方法

SPSS 16.0 软件行数据分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用方差分析（ANOVA）（方差齐时，方差齐组间比较采用LSD-t检验，方差不齐采用Dunnett’ T3检验），以 P

2.1TTC 染色

结果显示：A组（图1A）呈红色，缺血组织呈白色， C组（图1C）梗死区范围较B组变小（图1B）。脑梗死体积百分比：与B组（43.0±3.1）%比较，C组（26.0±1.8）%较B组显著降低，差异具有统计学意义（P

A.假手术组；B.缺血-再灌注组；C.萝卜硫素干预组

图1脑组织TTC 染色

Fig 1Infarct volume was measured by TTC staining in each group

2.2缺血脑组织HE染色

A组脑组织神经元胞浆丰富，形态正常；血管内皮细胞完整，管周组织致密；B组脑间质疏松呈筛状，神经元排列散乱，大量细胞变性坏死，胶质细胞增生明显，血管管周间隙增大；C组完整可辨的神经细胞数量明显增多。见图2。

A.假手术组；B.缺血-再灌注组；C.萝卜硫素干预组

图2大脑组织HE染色（HE×200）

Fig 2The morphologic of focal cerebral changes by HE（HE×200）2.3皮质神经元凋亡变化

凋亡神经元阳性细胞表现为细胞核呈棕黄色。与A组（图3A）比较，B组 （图3B） 可见神经元细胞凋亡显著增加（12.72±1.74）vs.（124.65±3.85），（t=45.9，P

A：假手术组；B：缺血-再灌注组；C：萝卜硫素干预组

图3TUNEL 法阳性细胞染色（×200）

Fig 3The neuronal apoptosis of focal cerebral changes were observed by TUNEL assay（×200）

2.4iNOS mRNA和 NF-κB p65 mRNA表达

B组iNOS mRNA水平较A组显著升高（t=13.2， P

2.5iNOS 及NF-κBp65蛋白表达

与A组比较，B组iNOS显著升高[（0.79±0.05） vs. （0.18±0.02）]；B组比较，C组iNOS明显下调[（0.47 ±0.02） vs. （0.79±0.05），P

A：假手术组；B：缺血-再灌注组；C：萝卜硫素干预组

图4各组脑组织 iNOS mRNA相对表达水平

Fig 4Expression of iNOS mRNA at 24 h after ischemic reperfusion

A.假手术组；B.缺血-再灌注组；C.萝卜硫素干预组

图5各组脑组织NF-κBpmRNA相对表达水平

Fig 5Expression of NF-κBpmRNA in each group at 24 h after ischemic reperfusionA：假手术组；B：缺血-再灌注组；C：萝卜硫素干预组

图6iNOS和NF-κBp65蛋白含量

Fig 6the levels of iNOS and NF-κBp65 protein in each group rats at 24 h after ischemic reperfusion

萝卜硫素是是NF-E2相关因子2（NF-E2-related factor 2，Nrf2）重要的激活剂，能够诱发Nrf2活化转位入核与抗氧化反应元件结合，上调Ⅱ相解毒酶的表达[7]，清除自由基、抑制炎症反应和细胞凋亡，但是对于局灶性脑缺血-再灌注损伤的研究少有报道。本实验发现大鼠左侧中动脉缺血-再灌注后，导致右侧肢体肌无力，运动时向右侧打圈，甚至昏迷等；HE染色结果显示，大鼠局灶性脑缺血-再灌注损伤后组，脑病灶部位间质疏松呈筛状，可见神经元排列散乱，大量细胞变性坏死，胶质细胞增生明显等，上述说明模型复制成功。本实验中采用腹腔注射SFN处理后局灶性脑缺血-再灌注损后脑梗死体积下降，提示脑损伤减轻，完整可辨的神经细胞数量明显增加，细胞坏死情况显著减轻，据此提示SFN具有脑保护作用。

NF-κB是Cox-2，iNOS， Bclxl，CIAPs以及 cyclin D1炎症因子的上游调节蛋白，参与炎症相关基因的表达[8]，NF-κB p50/p65异源二聚体是NF-κB活化的最常见形式，其中NF-κBp65具有基因调控功能，在炎症反应中起着至关重要的作用[9]。在静息状态下与抑制蛋白IκB 家族的成员结合成为无活性的复合物存在于细胞胞浆中，氧化应激代谢产物、缺血-再灌注等可诱导IκB磷酸化以及蛋白降解， 使IκB和NF-κB分离， NF-κB迅速活化，进入细胞核，激活如iNOS等的转录。近年研究表明，NF-κB存在于脑神经元中，与脑缺血-再灌注损伤的炎性反应机制密切相关[10]。与此同时，其在调节细胞凋亡中也扮演着重要角色，诱导细胞促凋亡基因表达，促进神经元凋亡[11-12]，抑制NF-κB的激活，减少细胞凋亡及炎症反应[13]。本实验发现假手术组NF-κBp65 mRNA和 NF-κBp65 蛋白表达水平较低，凋亡神经元细胞极少，而脑缺血-再灌注损伤组缺血区脑组织中NF-κBp65 mRNA和 NF-κBp65 蛋白表达水平明显上调，凋亡神经元细胞显著增加，萝卜硫素干预后能抑制NF-κBp65 mRNA以及NF-κBp65蛋白表达，使再灌注损伤引起的神经元细胞的凋亡明显减少，表明萝卜硫素能能抑制NF-κBp65表达，对神经元细胞具有保护作用。

一氧化氮合酶（NOS）具有包括内皮型（eNOS）、神经元型（nNOS）和诱导型（iNOS）3种亚型。其中nNOS和iNOS则具有损害作用，在炎症反应时iNOS高表达，能促使NO的产生，具有强大的细胞毒作用。在生理状态下iNOS表达很少，而在缺血-再灌注等病理状态下，NF-κB的激活伴随着iNOS基因转录的启动，胞浆中iNOS高水平可促NO的产生，NO能干扰细胞正常代谢，产生自由基等，引起细胞凋亡时DNA的损伤[14]。本实验发现假手术组iNOS mRNA和 iNOS蛋白表达很少，凋亡神经元细胞极少，而脑缺血-再灌注损伤组缺血区脑组织中iNOS mRNA和 iNOS蛋白表达水平明显上调，凋亡神经元细胞显著增加，这点与NF-κBp65的表达具有一致性。萝卜硫素干预后能抑制iNOS mRNA和 iNOS蛋白表达，缺血-再灌注损伤所致的神经元细胞凋亡明显减少，表明萝卜硫素也能抑制iNOS的表达，使神经元细胞免于凋亡性损伤。

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（收稿日期：2013-05-16）

DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2013.12.010

基金项目：浙江省“十二五”高校重点学科“危重病与灾害救援医学”支持项目

作者单位：325027浙江省温州，温州医科大学附属第二医院育英儿童医院急诊科（曾潍贤、陈大庆、龚裕强、孙来芳），温州医科大学第一医院急诊科（卢中秋）

通信作者：陈大庆，Email：

p1346-p1351