阿司匹林对急性肺栓塞大鼠NF―κB的影响

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DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2014.04.012

基金项目：浙江省自然科学基金（Y207052，LY12H29005）；浙江省中医药防治重大疾病攻关计划项目（2012ZGG001）

作者单位：310006 杭州，浙江中医药大学附属第一医院ICU（王灵聪）；浙江中医药大学（张微）

通信作者：王灵聪，Email：

急性肺栓塞（Acute pulmonary embolism，APE），是由各种栓子堵塞肺动脉而致肺循环障碍的疾病，在欧美国家的发病率和病死率均较高，中国近年来也呈上升趋势。而APE机体存在广泛的炎症反应[1-3]，TNF-α、IL- 1β、IL-8的表达水平大大升高，研究发现[1]阿司匹林（aspirin）能改善APE的肺病理及炎症因子。有报道[4-6]APE发生后核因子κB（nuclearfactor -kappaB ，NF -κB）可升高，但未见aspirin进行干预的研究，本研究拟探索阿司匹林对急性肺栓塞大鼠nf-κB的影响。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物

清洁级雄性SD大鼠108只，体质量（250±20）g，购自无锡市惠山江南实验动物场，合格证号：SCXK（苏）2009-0005。

1.2 药物

aspirin肠溶胶囊（批号：W026，永信药品工业（昆山）有限公司）。

1.3 主要试剂和仪器

Rabbit polyclonal to NF-κB （Bioworld，工作浓度：1：200），SP免疫组化染色试剂盒（福州迈新生物技术开发有限公司），柠檬酸抗原修复液 （PH6.0） （福州迈新生物技术有限公司），DAB显色试剂盒（福州迈新生物技术有限公司）。NF-κB-P65 Antibody（ab7970，Abcam），β-Actin Antibody（sc-47778，Santa Cruz），Goat anti-Rabbit IgG-HRP（BS13278，Bioworld），Goat anti-Mouse IgG-HRP（BS12478，Bioworld）。主要仪器：转式切片机（RM2135型，LEICA公司），全自动组织脱水机（TP1020型，LEICA公司），石蜡包埋机（EG1140型，LEICA公司），摊片机（HI1210型，LEICA公司），烘片机（HI1220型，LEICA公司），光学显微镜（江南，BM-1000）。台式高速冷冻离心机（H1650R，上海卢湘仪），台式低速离心机（TDZ6B-WS，上海卢湘仪），电动玻璃匀浆机（DY89，宁波新芝生物科技股份有限公司），微量加样器（Bio-DL，大龙），酶标仪（SPECTRA max Plus 384，Molecular Devices公司），电泳系统（Mini-Proten Tetra System，Bio-RAD公司），凝胶成像仪（ ChemiDoc XRS+ System，Bio-RAD公司）。

1.4 动物模型建立与给药方法

108只SD大鼠按体重随机分为6组：正常组（control）、假手术组（sham）、模型组（model）、阿司匹林低（aspirin-low）、中（aspirin- medium）、高剂量组（aspirin-high），每组各18只。使用自体血栓复制APE动物模型[1-2] ：分离右颈总静脉，注射4 h前大鼠眼眶静脉取血制成2 mm3直径的血栓混悬液0.5 ml（约15～20个血栓），大鼠出现呼吸加快加深，即表明APE造模成功。而sham组自右颈总静脉注入0.5 mL NS，不用血栓混悬液注射，control不做任何处理。所有大鼠手术前1 d和40 min前分别按设计灌胃一次，aspirin-low、aspirin- medium、aspirin-high分别灌aspirin 150 mg/kg 、300 mg/kg、600 mg/kg，其余各组用等量生理盐水灌胃。造模后6 h、24 h、72 h各组灌胃相应药物，Control、sham和model每天灌胃等量NS 2 mL（与aspirin各组等量），每天1次，连续3日。实验期间，6组大鼠均自由饮水和进食。

1.5 指标检测

免疫组化染色检测肺组织表达NF-κB的阳性细胞数：免疫组化方法[1]，在显微镜下每张肺片随机取3个不重叠视野，每只大鼠观察4张肺片计算阳性细胞数，取均值为一只大鼠的结果。

Western免疫印迹分析肺组织NF-κB蛋白的表达水平：Western Blot方法检测左肺上叶NF-κB，根据Image J软件得出样品蛋白质NF-κB与β-Actin的光密度值，计算其与β-Actin光密度的比值，进行比较。

肺病理HE染色：选肺组织进行大体标本观察，用10%甲醛固定24 h，石蜡包埋切片，HE染色，最后由专业病理人员行显微镜检查。

1.6 统计学方法

采用IBM SPSS19.0 for windows统计软件，实验结果均以平均值±标准差（x±s）表示。免疫组化的比较采用随机区组的多因素方差分析，Western Blot比较采用单因素方差分析，组间均数的两两比较采用LSD法，以P

2 结果

2.1 aspirin能够明显减少表达NF-κB的阳性细胞数

光镜下观察可见NF-κB阳性表达呈棕褐色颗粒，在支气管上皮细胞、肺泡细胞、巨噬细胞及支气管平滑肌周围均存在不同程度表达，model更显著，见图1。

3个不同时间段的其余5组的NF-κB阳性细胞计数均显著小于model（P

2.2 aspirin能够下调APE大鼠肺组织NF-κB蛋白的表达水平

3个不同时间段的其余5组的NF-κB均显著小于model（P

2.3 aspirin能够改善APE大鼠肺组织的病变

model大鼠在造模后的6 h、24 h、72 h，均出现血栓、肺泡壁坏死和肺泡出血，有不同程度的炎细胞浸，aspirin应用后，肺组织充血及炎症程度明显减轻。见图3。

3 讨论

研究认为，APE后，肺内存在一个较广泛的炎症过程，且凝血后的产物及炎性细胞之间的互相作用可进一步加重其病理程度[1-3，7]。APE可产生多种炎症介质， 如血栓素A2、血小板活化因子、 IL-1 、IL-6、IL-8 等[2，8]。NF -κB[9]可因细菌、病毒而被激活，目前已证实，NF-κB 可诱导TNF-α、IL-1β 和 IL-6等过度表达，而使大量中性粒细胞聚集于炎症处，产生炎症反应，这些细胞因子同时又是 NF-κB 的刺激剂，故可进一步活化 NF-κB，而加重炎症反应。文献认为[4-6]APE发生后NFκB升高与肺部炎症有关，是加重肺损害的机制之一。研究发现大鼠发生APE后4 h和72 h，其肺组织TNF-α、IL-1β的mRNA比正常对照组要显著升高[2]。aspirin能不可逆抑制环氧化酶，从而抑制了血小板中血栓素A2的生成，也可阻止 NF-κB 的激活而发挥抗炎作用，因非类固醇抗炎药物不是特异的， 需要比较高的浓度才能有效抑制 NF- κB[10-14]，故本验中使用了大剂量的aspirin。而APE的治疗，主要为溶栓或华法林抗凝[15]，对于外周动脉血栓形成和移植物，aspirin多做为二线预防药物[16-17]。也有报告认为aspirin可用于防治APE[18-22]。文献认为aspirin 325 mg每天口服，连续3年，能有效而安全预防老年心房颤动梗塞性疾病的发生[23]。故APE后，NF-κB表达增加，可加重TNF-α、IL-1β和IL-6等细胞因子过度表达，而大剂量aspirin可尝试在临床上用于APE，以阻断其炎症反应，但需注意其出血等副反应，但aspirin能否真正降低APE后的NF-κB表达呢？

APE典型组织学特点是肺泡壁的坏死和肺泡出血，本实验通过对大鼠进行肺病理证实APE造模成功，造模后6 h、24 h、72 h肺组织有明显出血、炎性细胞浸润和明显的渗出，aspirin应用后，肺组织充血及炎症程度明显减轻，说明使用aspirin可减轻APE肺组织病理损害。对栓塞后肺组织NF-κB的蛋白表达水平进行了定性、定量检测，结果显示栓塞后6 h、24 h和72 h，aspirin三个治疗组的NF-κB阳性细胞计数明显低于模型组，而模型组则显著高于control和sham，说明栓塞后NF-κB表达增多，Western 免疫印迹实验结果也支持这一点；但不同剂量的aspirin 组，其阳性细胞计数高峰期也不同，aspirin-low在栓塞后24 h和72 h达高峰，aspirin-medium在栓塞后24 h达高峰，而aspirin-high在栓塞后6 h即达到高峰，说明aspirin剂量越大，可越早缩短NF-κB阳性细胞计数高峰期出现时间。笔者认为aspirin通过抑制NF-κB，进而抑制TNF-α、IL-1β等细胞因子，从而阻断APE后的炎症瀑布反应。

总之，aspirin能降低APE大鼠的肺NF-κB水平，与剂量有一定关系，可能是aspirin减轻APE肺组织损伤的机制之一。

参考文献

[1]孙晨， 王灵聪， 蒋慧芳， 等. 阿司匹林对急性肺栓塞大鼠肺组织CX3CL1及CX3CR1影响[J].中华医学杂志， 2013， 93（1）： 69-72.

[2]王灵聪，黄立权，孙晨， 等. 姜黄素对肺血栓栓塞症大鼠肺组织不规则趋化因子的影响[J].中华危重症医学杂志，2011， 4（5）： 250-254.

[3]孙同文， 张金盈， 李凌， 等. 阿托伐他汀对急性肺栓塞血清肿瘤坏死因子α和白细胞介素-1β的影响[J]. 中华急诊医学杂志， 2010， 19（9）： 942-943.

[4]Lu WJ， Lee JJ， Chou DS， et al.A novel role of andrographolide， an NF-kappa B inhibitor， on inhibition of platelet activation： the pivotal mechanisms of endothelial nitric oxide synthase/cyclic GMP[J]. Mol Med （Berl）， 2011 ，89（12）：1261-1273.

[5]Peng CK， Huang KL， Wu CP， et al. The role of mild hypothermia in air embolism-induced acute lung injury[J]. Anesth Analg， 2010， 110（5）： 1336-1342.