栀子活性成份分析
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【中图分类号】R917 【文献标识码】 A【文章编号】1672-3873（2011）03-0298-01
【关键词】栀子 活性成分
1、仪器与材料
FisherJohns熔点仪（未校正），SHIMADZU FTIR8400S红外光谱仪，Bruker AM 500型核磁共振仪， Thermo Scientific LTQ Orbitrap质谱仪，上海亚荣旋转蒸发仪RE 2000，SpectraMax 190酶标仪(美国Molecular Devices公司)，薄层板和硅胶（青岛海洋化工厂），Sephadex LH20为Pharmacia产品，其他试剂均为分析纯（MTT,美国Sigma公司）。
细胞株：HL60人早幼粒细胞白血病、REH人急性淋巴细胞白血病、Raji淋巴瘤（北京协和医学院/中国医学科学院基础医学研究所）
栀子样品于2008年3月购自北京同仁堂京北康大家园药店，经林余霖研究员鉴定为栀子Gardenia jasminoides Ellis。植物标本存放于中国医学科学院药用植物研究所标本馆，编号为R001。
2、方法
2.1 提取与分离
焦栀子（1 kg）经过粉碎，用体积分数95%乙醇回流提取3次，每次2 h，提取液减压浓缩得浸膏100 g，称取硅胶(100～200目)210 g拌样，上硅胶色谱柱,用三氯甲烷甲醇（体积比100∶1～0∶100）洗脱：三氯甲烷甲醇（体积比95∶5）洗脱部分可得到化合物1（15 mg）、化合物2（6 mg）、化合物3（18 mg）；三氯甲烷甲醇（体积比9∶1～8∶2）洗脱得化合物5（1 853 mg）、化合物6（9 mg）、化合物7（8 mg）；三氯甲烷甲醇（体积比7∶3）洗脱得到化合物8（10 mg）；三氯甲烷甲醇（体积比6∶4）洗脱得到化合物4（120 mg）。
2.2活性筛选
粗提物、各组分及化合物以二甲基亚砜（DMSO）溶解，配成50 mg•mL-1的储备液，-20 ℃保存。临用时用含10%胎牛血清（FBS）的RPMI1640培养液稀释，配制所需浓度（终浓度样品中DMSO含量
生长抑制率=给药组A值-调零组A值细胞空白对照组A值-调零组A值×100%
3、结果与讨论
3.1结构鉴定
化合物1:无色片状晶体（三氯甲烷），mp 142～143 ℃。EIMS m/z：414(M+)，与文献［3］报道数据一致；与对照品β谷甾醇共薄层层析，两者的Rf值、斑点颜色完全一致。鉴定为β谷甾醇。
化合物2:无色针晶(石油醚)，1HNMR(500 MHz，CDCl3) δ：3.96［6H，s，(CH3)2 C3′, C5′OCH3］，3.93(3H，s，C7OCH3)，3.89(3H，s，C4′OCH3), 6.38(1H，d，C8H)，6.50(1H，d， C6H)，6.60(1H，br s， C3H)，7.08(2H，s，C2′H，C6′H)，12.72(1H，br s，C5OH)。以上数据与文献报道一致，确定为5羟基7，3′，4′，5′四甲氧基黄酮。
化合物3: 白色结晶，mp 269～270 ℃。13CNMR(DMSOd6)δ: 38.3(C1)，23.7(C2)，76.7(C3)，38.3(C4)，52.3(C5)，21.0(C6)，32.6(C7)，38.4(C8)，46.7(C9)，38.1(C10)，24.0(C11)，124.5(C12)，138.1(C13)，41.6(C14)，30.1(C15)，21.0(C16)，46.9(C17)，54.7(C18)，28.2(C19)，27.5(C20)，26.9(C21)，36.2(C22)，22.8(C23)，16.9(C24)，16.0(C25)，15.1(C26)，23.7(C27)，178.2(C28)，21.2(C29)，23.2(C30)。上述数据与文献报道一致，与标准品进行薄层层析对照，Rf值一致，鉴定为熊果酸。
化合物4:无色针状结晶，mp 167 ℃。ESIMS m/z： 181［MH］-。 IR (KBr)cm-1： 3 260， 2 940，
1 470，1 105，1 030。以上数据与文献报道一致。13CNMR(DMSOd6) δ：71.3(C2,5)，69.6(C3,4)，63.8(C1,6),综上所述鉴定为D甘露醇。
化合物5: 白色粉末(三氯甲烷)，mp 163～164 ℃。ESIMS m/z：411［M+Na］+。1HNMR(500 MHz，DMSOd6 ) δ：7.45(1H，s，H3)，5.66(1H，brs， H7)，5.11(1H，d，J=6.8Hz，H1)，3.66(3H，s，COOCH3),4.14(q，2H，H10a，10b)。以上数据与文献报道一致，确定为栀子苷。
化合物6: 无色粉末（甲醇）。ESIMS m/z：427 (M++Na)，1HNMR(500 MHz，DMSOd6) δ：7.56(s，H3)， 5.87(s，H7)，4.92(d，J=8.5 Hz,H1)，4.56(d，J=8 Hz， H1′)， 4.27(q，2H，H10a，10b)， 3.1～3.4(m, 4H，H2′，4′，3′，5′ )。以上数据与文献报道基本一致，鉴定为去乙酰车叶草苷酸甲酯。
3.2活性筛选结果
活性筛选结果显示，化合物3(熊果酸) 对3种白血病细胞增殖均表现出了一定的抑制作用，其中对REH细胞系抑制活性最强，IC50为7.5 μg/mL。
有关熊果酸对急性淋巴细胞白血病细胞的抑制作用此前未见文献报道。本文结果表明，栀子提取物中抑制细胞增殖的活性成分主要在低极性部位，水溶性部分没有显示细胞抑制作用。在分离的得到的化合物中，三萜类成分熊果酸显示出了较强的体外活性，对3种白血病细胞均有一定的抑制作用，尤其对急性淋巴细胞白血病REH细胞株有较强的抑制作用；而其他化合物均没有细胞抑制作用（IC50值大于160 μg•mL-1）。
民间治疗急性淋巴细胞白血病通常是取30～40个焦栀子加水煎汤。30～40个栀子大约25～35 g，熊果酸在栀子中的质量分数约为0.03%～0.04%，相当于约100 mg左右熊果酸的用量，这一用量可在体内一定程度上达到抑制白血病细胞增殖的起效剂量。因此，熊果酸可能为栀子治疗急性淋巴细胞白血病的一个活性成分。当然，栀子中其他成分在治疗急性淋巴细胞白血病中发挥的作用及其机制可能也不可忽略，例如虽然本文中水溶性部分没有显示直接的抑制白血病细胞增殖的活性，但文献研究发现栀子多糖具有比较广谱的体内抑瘤效应，栀子中环烯醚萜有机酸酯类成分具有抗氧化和抗炎活性，这些活性作用可能对急性淋巴细胞白血病的治疗也发挥一定的辅助作用。
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