枳子的生药鉴定及质量初步研究

开篇：润墨网以专业的文秘视角，为您筛选了一篇枳子的生药鉴定及质量初步研究范文，如需获取更多写作素材，在线客服老师一对一协助。欢迎您的阅读与分享！

【摘要】目的 对枳子进行鉴定,为其制定质量标准提供参考依据。方法 以槲皮素为对照品，采用薄层色谱法对枳子药材醇提物进行了定性鉴别及含量测定。结果 含量测定中,槲皮素在1.31～5.26 μg 范围线性关系良好(r =0.9999),回收率为99.78%,RSD=1.08%。结论 TLC 鉴别方法专属性强；含量测定方法精密度高,重复性好,简便快速,可用于枳子生药鉴定的质量提供依据。

【关键词】枳子 槲皮素 生药学鉴定 质量标准 高效液相色谱法 薄层色谱法

中图分类号：R282.5文献标识码：B文章编号：1005-0515（2011）8-247-02

枳子为鼠李科(Rhamnaceae)拐枣属(Hovenia)植物枳(Hovenia dulcis Thunb)的带肉质果柄的果实或种子,具有止渴除烦、解酒毒、镇惊、利尿之功效,用于醉酒、烦热、口渴、二便不利。枳子作为传统中药材应用历史悠久。本课题组研究发现：枳子醇提取物能提高急性肝损伤小鼠的还原型谷胱甘肽(GSH)氧化功能,增强谷胱甘肽巯基转移酶(GST)催化的GSH 结合反应,增加超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(Cat)活性,拮抗乙醇所致的小鼠急性肝损伤,75%乙醇提取物具有明确抗肝纤维化作用[2-3]。已从枳子中分离得到含有槲皮素等多种黄酮类化合物[4-9],可能是其药效部分[5]。目前关于枳子的质量标准的报道尚未见到。本以槲皮素为对照品,采用薄层色谱法(TLC)和高效液相色谱法(HPLC)对枳子进行质量控制,为枳子开发成中药的新药奠定基础。

1 材料

1.1 实验材料 采自湖北建始华康医药公司与恩施州食药检所鉴定为枳子的果实或种子。

1.2 仪器Leica－Mps60 生物显微镜。

1.2.1 原植物鉴定 枳子是落叶乔木，高达10米多，嫩枝、幼叶背面、叶柄和花序轴初有短柔毛，后脱落。叶互生，广卵形，长8～15cm，宽6～10cm，先端渐尖或长尖，基部圆满呈心形，常不对称，边缘有粗锯齿，表面无毛；叶柄红褐色，背面沿叶脉或脉间有柔毛。聚伞花序腋生或顶生，花杂性，同株；萼征5；花瓣5，黄绿色，直径约4.5毫米；花瓣扁圆形，两侧卷起，包裹雄蕊；花柱常裂至中部或深裂。雄花有雄蕊5，有退化子房；两性花有雄蕊5，子房埋没于花盘中，3室，柱头3裂。果实圆形或广椭圆形，生于肉质扭曲的花序轴上。花期5～6月，果期8~10月。

1.2.2 性状鉴别 枳种子扁平圆形，背面稍隆起，旗面较平坦，直径-5mm，厚1-1.5mm.表面红棕色、棕黑色或绿棕色，有光泽，于扩大镜下观察可见散在凹点，基部凹陷处有点状淡色种脐，顶端有微凹的合点，腹面有纵行隆起的种脊。种皮坚硬，胚乳白色，子叶淡黄色，肥厚，均富油质。气微，味微涩。

1.3 仪器与试药

HHS 精密恒温水浴锅(江苏金坛市医疗仪器厂)；52OOH超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)；RE-52CS 型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵(鄂州长城科工贸有限公司)；YXJ-1 型离心机(深圳天南海北实业有限公司)；Agilent 1100 型高效液相色谱仪；DAD检测器。薄层板为以羧甲基纤维钠为粘合剂的硅胶G 预制板。水为双蒸水,乙腈为色谱纯,其他试剂均为分析纯。

槲皮素对照品(中国药品生物制品检定所,供含量测定用,批号081-9003)；枳子药材购自湖北建始华康药业公司提供,经湖北恩施州食药检所鉴定为鼠李科植物枳(Hovenia dulcis Thunb)的种子。

2 方法与结果

2.1 TLC 鉴别

取3 批枳子粗粉各0.5 g,分别以75%乙醇为溶剂,索氏提取3.2 h,提取液过滤,减压回收乙醇至无醇味,热水分散,放冷,石油醚(60～90 ℃)脱脂3 次,水液浓缩,80 ℃干燥制成干浸膏,粉碎成细粉。加醋酸乙酯回流提取2 次,每次15 min,每次15 mL。合并醋酸乙酯液,水浴蒸干,残渣加甲醇2 mL 使溶解,作为供试品溶液。另取槲皮素对照品,加甲醇制成每1 mL含0.33 mg 的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法[《中国药典》2000 版(一部)附录ⅥB]试验,吸取上述2 种溶液各10 μL,分别点于同一硅胶G 薄层板上,先以醋酸乙酯-甲酸-水(8∶1∶0.8)为展开剂,饱和10 min,展至约4 cm,取出,晾干；再以甲苯-甲酸乙酯-甲酸(5.5∶2∶0.3)为展开剂,展至约10 cm,取出,晾干,喷以1% AlCl3 乙醇溶液,待乙醇挥干后,置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中,在与对照品色谱相应位置上,显相同颜色的荧光斑点。

2.2 含量测定

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取经五氧化二磷减压干燥器中干燥至恒重的槲皮素对照品16.5 mg 于25 mL 量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,定容,摇匀,即得660μg/mL 的对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取枳子粗粉0.5g,按2.1 项下同法操作至“粉碎成细粉”。精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇25 mL,称定重量,超声处理(功率125 W,频率40 kHz)15 min,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,续滤液过0.45μm 微孔滤膜,即得。

2.2.3 色谱条件 色谱柱：ZOPBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm)；流动相：乙腈-0.02 mol/L KH2PO4(35∶65),用磷酸调节pH 值为4.1；检测波长：256 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；理论塔板数按槲皮素峰计算不低于2500。在该条件下槲皮素与其他组分均能达到基线分离,阴性对照品在槲皮素色谱峰的保留时间处无干扰。

2.2.4 线性关系的考察 精密吸取对照品溶液1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL,分别置于10 mL 容量瓶中,加甲醇定容,摇匀,分别取各浓度对照品进样20 μL,按上述色谱条件依序进样测定。以槲皮素对照品浓度(μg/mL)为横坐标,色谱峰面积为纵坐标,绘制标准曲线, 建立回归方程：A =19.22+792.01C ,r =0.9999, 结果表明, 槲皮素浓度在1.31～5.27 μg 范围内与色谱峰面积线性关系良好。

2.2.5 精密度试验 精密吸取660 μg/mL 槲皮素对照品2.0 mL,重复进样5 次,测得日内RSD=1.30%,隔日再重复进样5 次,测得日间RSD=2.1%。

2.2.6 重复性试验 取同一批次枳子粗粉按2.2.2 项下制备供试品溶液5 份,依序进样测定槲皮素含量,结果平均含量为2.67 μg/mL,RSD=1.6%。

2.2.7 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液,分别于0、2、4、8、12、24 h 进样,依法测定,由峰面积积分值统计结果,可见样品溶液在24 h 内保持稳定,RSD=2.7%。

2.2.8 加样回收率试验 精密称定已知槲皮素含量的枳子粉末适量,共5 份,分别以高、中、低3 个浓度水平准确加入一定量的槲皮素对照品,按上述供试品溶液制备方法和色谱条件进行测定并计算回收率。结果平均回收率为98.7%, RSD=1.08%。结果见表1。

表1 加样回收率测定结果(n =5)

2.2.9 样品的含量测定 分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液20 μL,注入高效液相色谱仪,依法测定,结果见表2。经过对3 批枳子药材的含量测定,并经统计学处理,规定枳子药材中槲皮素含量不得少于0.702 mg/g。

表2 槲皮素含量测定结果(x±s,n =3)

3 讨论

枳子中总黄酮常用的提取溶剂有水、不同浓度的乙醇等,提取方法有浸渍法、渗漉法、索氏提取法、回流法等[6],总体分为冷提和热提两种方式。故用不同溶剂、不同方法进行提取,以干浸膏得率和槲皮素含量为指标,并结合药效学实验结果进行了对比实验,结果表明：枳子提取方法以75%乙醇为提取溶剂,索氏提取器提取法最佳。

对槲皮素对照品溶液进行紫外可见光全波长扫描,结果在360 nm 和256 nm 处均有较大吸收,比较相同色谱条件下360 nm 和256 nm 波长下的色谱图,检测波长为256 nm 时的色谱图具有分离度好、灵敏度高、杂质干扰少的优点,因此,采用256 nm 为检测波长。

在枳子槲皮素含量测定条件中,磷酸的加入作用有二：其一,流动相中加入磷酸,可抑制黄酮苷酚羟基的电离,改善分离效果,防止拖尾,使峰形尖锐、对称,缩短分离时间；其二,流动相的pH 值对测定影响显著,采用磷酸调节一系列不同pH值的缓冲溶液进样检测,结果发现,pH 值偏大或偏小,分离效果不好,拖尾现象较严重,因此,优选pH=4.1,分离效果好。

本实验组研究发现,枳子的种子在75%乙醇提取物具有抗脂质过氧化和抗肝纤维化的作用,通过对枳子有效部位的初步研究,总黄酮可能是其药效部分,因此,对枳子黄酮化合物中槲皮素含量测定的研究具有积极的意义。结果表明,该方法简便可行,准确可靠,重复性好,能有效地控制该药物的质量。

参考文献

[1]嵇扬, 杨平, 李俊. 枳子酒与枳子水提取液解酒毒作用比较研究[J]. 时珍国医国药, 2001, 12 (6) : 4812483.

[2] 徐亚军,郭华春. 黄山药的研究进展[J]. 中国农学通报, 2005,21 (2) : 94.

[3] 胡志林,刘文娜,张永军.枳子中总黄酮提取工艺研究[J].中成药,2004,26(12)：1065.

[4] 李克明, 任丽娟. 枳子化学成分研究. 黄酮类成分的分离与鉴定[J ]. 中草药, 1999, 30 (增刊) : 60260.

[5] 张 洪,叶丽萍,张如洪,等.枳子有效部位的初步研究[J].广东药学院学报,2003,19(2)：111.

[6] 施 震,张 洪,尹银嘉.枳子提取物抗实验性纤维化[J].中国医院药学杂志,2002,22(9)：534.

[7]白洪龙, 黄传贵1 中草药功效归类大全[M]1 昆明: 云南科学技术出版社, 19941

[8]谢宗万, 余友岑1 全国中草药名鉴[M]1 上册1 北京: 人民卫生出版社, 19961

[9] 张 洪,何 文,李志建.枳子提取物对乙醇所致小鼠肝损伤的拮抗作用[J].广东药学院学报,2001,17(3)：180.