活性氧簇的第一道防线
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简介
皮肤是抵御环境侵害的第一道防线。由于暴露于日晒，氧和有害化学物质，皮肤的完整性受到了影响。这些皮肤外来的侵害主要源于自由基的形成。如超氧化阴离子、过氧化氢、一氧化氮和羟基自由基，为常见的活性氧簇或称为ROS，是引起发炎、刺激、皮肤变色和内在老化的主要原因。生活在阳光、氧环境中需重点防护活性氧簇。
皮肤本身已经能够对抗多种ROS的侵袭。在这些防护中主要有很多不同的酶，如超氧化歧化酶(能将超氧化阴离子基团转化为过氧化氢)和过氧化氢酶(能够将过氧化氢转化为水和氧气)。但是，其中一个活性氧簇――一氧化氮，在皮肤损坏和内在老化方面起的作用一直被忽视(至少说在健康皮肤上)。其原因很简单，没有特殊的酶可以调节过量的一氧化氮。这是不是意味着这种活性氧可以肆无忌惮地横行于皮肤?
事实并非如此。在血液中，一氧化氮是有效的血管舒张剂，控制血管的舒张和收缩直到真皮层的微毛细血管。当一氧化氮的浓度超出平衡状态时，人体会通过氧运输蛋白、血红细胞中的血红蛋白，排除多余的一氧化氮。相似的，在神经系统里面，多余的活性氧用神经球蛋白进行处理，在肌肉中，氧气运输和自由基控制是通过肌红蛋白进行处理。身体在所有的关键部位使用这些球蛋白，那皮肤是不是可能使用相似的防御机制?最近一种新型球蛋白――细胞球蛋白(普遍存在于身体)的发现，产生了一种新的皮肤抵御ROS的机制。
有趣的是，现在发现所有的绿色植物同样含有球蛋白，其功能也是作为传输氧气和保护植物对抗内部ROS。以下将描述球蛋白在植物和人体中的作用，着重于植物和大多数热血哺乳动物内球蛋白的相似点。然后介绍一种植物球蛋白一豆血红蛋白，能够代替人体球蛋白控制人体内的ROS，特别是一氧化氮。对一氧化氮的控制会影响一些主要的皮肤反应如发炎，刺激和黑色素形成。最后会讨论到球蛋白的一种可能的作用，特别是细胞球蛋白，作为细胞的氧气运输体并促进胶原蛋白合成中关键酶的合成。
细胞蛋白
人体内含量丰富的球蛋白，它是通过不同氨基酸包围着一个含有铁活性中心的独特的“球形”蛋白。在球状蛋白的折叠环境中，铁元素以Fe+2(亚铁离子)或Fe+3(三价铁离子)的形式存在，而且这种金属元素在这两种形态中往复循环，使氧气和二氧化碳在血液中运输的特殊行为成为可能。然而球蛋白并不只是简单地结合氧气和二氧化碳，更能很好的结合其他一些小分子如一氧化碳和氰根离子。因此，有充分的理由确定球蛋白能结合一氧化氮。
截止2002年体内已发现的球蛋白只有三种：血红蛋白(在血红细胞中)、肌红蛋白(在肌肉细胞中)和神经球蛋白(在神经细胞中)。在2002年，两个独立的实验室几乎是同时报告发现了人体内的第四种球蛋白。这种蛋白质被Burmester等命名为“细胞球蛋白”。有趣的是，不像其他三种已经被确认的球蛋白，细胞球蛋白存在于许多不同类型的部位和组织中。细胞球蛋白存在的作用和作用机制目前还未发现。然而，BermesterTfflHargrove(该蛋白的共同发现者)都认为细胞球蛋白很可能在控制活性氧方面起作用，可能在细胞处于缺氧环境(即氧气缺乏)下的时候促进氧气的运输。最近，Burmester等表示在老鼠皮肤的成纤维细胞中发现细胞球蛋白，虽然这些发现还有待证实。Burmester认为，可能球蛋白除了控制ROS、传输氧气外，还能影响到聚-4羟化酶――成纤维细胞中胶原蛋白合成所需的酶。
固氮作用――植物和微生物的共生关系
植物同样产生球蛋白。事实上，如图1所见，在豆科植物如大豆和莲属植物中形成的球蛋白和哺乳动物的球蛋白――肌红蛋白惊人的相似。同样豆血红蛋白(六价固定铁核心结构)也与人类细胞球蛋白有着接近的相似性。
有一类特殊植物――豆科植物(有将近850个属和1，800种)已经引发了科学想象。随着进化，豆科植物根部已经能够适应微生物如根瘤菌。在共生关系中，微生物钻入植物的微根毛中，建立小巢成为“共生体”。在环境中，微生物能够被保护不受氧环境的损害。在共生体中，微生物利用植物的资源作为营养、水分、维他命、矿物质和其他生命必须组分生长。作为回报，微生物提供给植物必须的含氮肥，如氨和硝酸盐――固定大气中的氮气和转化这种气体成为如氨(一种常见农业肥料)之类的有用肥料。
豆科植物储存养料形成必需的氨基酸、蛋白质、酶、碳水化合物和其他生长生存必须的关键组分。固氮是地球氮循环重要的环节。没有它，这个星球上就不可能有人类生命的存在。人是无法在氮气含量高达80％的大气中生存的。
豆血红蛋白
在固氮作用中重要的酶是固氮酶：它对氧气和活性氧的存在十分敏感。所以当微生物还需要氧气生存，生产ATP和消耗养料的时候，这种微小有机体已经进化出限制多余氧气和ROS这些可能损害固氮酶的机制了。这种微生物促使植物合成许多不同的保护性组分，包括维生素、抗氧化剂、酶(如超氧化歧化酶)、植物生长调节因子(如激动素)和黏多糖这些或是直接作用于活性氧，或是通过一些方式阻止活性氧进入共生体。防护性的“生态库”中的一种主要成分是一种独特的球形蛋白，称为“豆血红蛋白”。如在前面提到的，豆血红蛋白具有和人类球蛋白惊人相似的结构。
豆科植物根瘤的分离比较简单，大量的共生体可以在冷冻条件下长期保存。用水萃取浸软的共生小体后，可生产一种新的能够应用于部分化妆品的原料。用这种方法，奥麒个人护理品部门已经开发出两种新的源自大豆共生体和百脉根共生体的共生体提取物。其他的豆科植物目前仍在研究中。由于这种提取液是来自植物的根部，它结合了微生物和与其共生的植物提供的生物活性组分。因此可以预期，这些提取物中的许多活性组分或许相似，但是由于每种植物的不同，因此每种不同植物共生体提取物的精确成分也不同。同样，植物生长的土壤不同，可能导致形成独特的取决于植物生长地的活性原料。大豆在许多国家普遍种植，在美国尤其广泛，百脉根(Lotus japonicus)则主要在亚洲地区生长。然而，所有固氮共生体普遍含有球蛋白，特别是豆血红蛋白。随后研究发现，这种高含量生物活性提取物被证明是过剩一氧化氮自由基的强力清除者。
大豆根瘤提取物
一种提取自大豆共生体的提取物(INCI名称：大豆[Glycine max]共生体提取物)，豆血红蛋白的标准含量在0.05和0.3mg/ml之间，提供独特的一氧化氮清除功能。抗氧化物包装以及保湿成分，可以进一步增强作为预防皮肤光老化原料的功能性。体外实验：完整厚度组织模型实验方法
人类完整厚度组织模型提供一种确定产品在皮肤生理系统的功效和活性成分渗透角质层的评估。使用MatTek EpiDerm EFT-200检验1％的大豆根瘤提取物对众多
的导致亚临床红斑病的关键酶的影响。使用紫外线照射作为这些酶的激活剂和一氧化氮产生的刺激源。使用ELISA技术，几个刺激的关键标志酶包括IL-alpha，TNF-alpha和PGE2被检出。此外，导致皮肤胶原蛋白和弹性蛋白分解的胶原酶，如活性MMP-1，同样被检出。所有的这些生化信号都源于UV照射和一氧化氮上调。该组织模型同样可以检验实验样品引起的任何细胞毒性和实验样品控制一氧化氮的能力。
UV照射以及UV照射和1％大豆根瘤提取物对完整厚度组织的作用包括了酶反应、组织存活能力和一氧化氮的生成。“上升”显示所测量的活性在统计数据上的显著增加，“下降”显示所测量的活性的减少。UV刺激组织的数据与无刺激对照物相比较，1％大豆根瘤提取物处理组织的数据与刺激组织相比较。
结果和讨论
实验结果如表格1中所示。数据显示将组织用紫外光照射导致一氧化氮自由基增加，细胞的存活能力下降，增加刺激级联酶和胶原酶的生成。使用1％的大豆根瘤提取物控制了三种红斑标志酶中的其中两种的形成，并影响胶原酶的产生。此外，数据显示该提取物能够减少由UV照射而形成的组织中一氧化氮的产生。
体内实验
方法
进行体内实验证明大豆根瘤提取物在使用1 MED的uV-B照射后的抗刺激作用。利用多普勒激光仪测量亚临床红斑病的皮肤微循环，该实验方法是被认为对测量皮肤中亚临床改变最准确的方法。实验方案包括如下应用：未处理部位，安慰剂(水和凝胶成分)，预防部位即在UV照射前涂抹含1％大豆根瘤提取物的载体，即UV照射后立即涂抹相同的实验产品和UV照射后2小时涂抹实验产品。微循环的增加和亚临床红斑的增加相关，同时微循环的减少预示着亚临床红斑的减少。
结果
图2说明24小时测量值和12小时测量值的不同的实验数据，提供了在12小时自然康复过程中减少红斑程度。
讨论
以上的体外和体内实验结果支持关于大豆根瘤提取物活性机制和主要活性组分…豆血红蛋白的理论。由体内和体外实验数据可以看出豆血红蛋白能够控制由uV刺激产生的NO。如果在一氧化氮自由基形成前使用该活性物质，豆血红蛋白有效抑制NO，最大限度减少红斑。如果辐射后立即使用该活性物质，红斑的减少仍然明显，但是不如辐射时有该物质存在明显。在辐射过后几个小时后使用大豆根瘤提取物降低了该产品的有效性。这些数据支持大豆根瘤提取物中活性原料的结论，即该活性原料为豆血红蛋白，一种强效自由基清除剂，但是它在皮肤中自由基产生或是皮肤自然防护机制开始清除多余自由基之初就必须存在。
大豆根瘤提取物能够使UV光照射导致的刺激过程中产生的自由基最少化。减少一氧化氮自由基的产生能够帮助减轻由高度uV照射皮肤引起的红斑(亚临床红斑)。红斑的减少能够帮助预防由UV辐射引起的长期负面作用一包括光老化，皱纹和松垂。
百脉根根瘤提取物
最近得知，黑色素合成的一种机制是当UV-B刺激一氧化氮合成酶的形成时，由一氧化氮自由基的形成引发酶阶式反应开始，酶将精氨酸转化为瓜氨酸，释放出一氧化氮。一氧化氮自由基的形成通过“NO-cGMP”途径上调cGMP。最后，cGMP使酪氨酸酶上调，酪氨酸酶促进DOPA通过一种蛋白质激酶c途径形成黑色素的。该过程的关键是鸟苷酸环化酶，一种血红素基的酶，能够结合一氧化氮上调eGMP。
百脉根根瘤菌的提取物(INCI名称：百脉根共生体提取物)被发现含有大约0.5-0.7mg／ml的豆血红蛋白。从莲属共生体提取的豆血红蛋白能够与鸟苷酸环化酶竞争结合一氧化氮，通过控制cGMP的上调减缓酪氨酸酶的形成，如图3所示。
体外实验：人类成纤维细胞中cGMP的产生
方法
使用人类真皮成纤维细胞，用一个常用的一氧化氮给予体Spermine NONOate引发UV-B照射的特征产物一氧化氮(15)。使用ELISA技术确定真皮成纤维细胞中产生的cGMP含量。
结果
应用ELISA测量细胞中的cGMP浓度，结果证实了百脉根共生体提取物能够下调cGMP的生成，使用10％的浓度时候能够使cGMP的含量恢复到正常水平(图4)。
体外实验：在组织模型中测量黑色素形成
方法
cGMP下调被认为百脉根共生体提取物可能能够改善肤色，该假设被体外实验进一步证实，该体外实验使用的组织模型为MatTek(Ashland，MA)的Melanoderm(黑人皮肤)。该组织支架由成纤维细胞和角化细胞和不同的角质层(其中的黑素细胞嵌入浅层真皮层)组成。在该组织的角质层表面使用实验样品，样品必须透过表层渗入组织的深层才能发挥功效。
结果和讨论
在Melanoderm模型上连续每天使用10％浓度的百脉根共生体提取物，10天后测量黑色素含量，统计数据显示与未处理的对照物相比黑色素的含量显著下降。显微照片与数据结果相近，验证了黑色素合成分析中的数据，并且肤色的变浅甚至可以肉眼观察(图5)。
体内实验：色素沉积实验
方法
为了进一步证实百脉根共生体提取物作能够改善肤色，进行了10天152,色素沉积临床实验。色素沉积实验评价其淡化或加深UV-B引起的色素沉积斑点的功效，斑点是皮肤暴露在高水平的UV-B照射下产生的。色素沉积是人为引起的皮肤反应，能够评估通过自由基抑制改善肤色的能力。实验观察到的淡斑作用可表明其改善肤色的趋势。
实验对象选择的皮肤类型为Fitzpatrick Ⅲ和Ｖ型；他们有被轻度或中度烧伤为部分或完全棕黄色皮肤，15名中有9名亚洲人。实验评价2％的百脉根共生体提取物，以2％的曲酸作为对照。
实验的第一天，对参加者背部试验部位进行标记待测量。用色度测量仪对肤色进行测量。用L*a*b*色度等级读数，该色度等级中E*定义为皮肤的总色度反应。E*=[L*2+a*2+b*2]1/216。B*增加表明淡化肤色(即亮肤作用)。
用引发红斑的最小剂量(MED)的两倍量的UVB刺激皮肤，引起实验部位的色素沉积。为了确定实验产品能够淡化或加深UV-B引起的色素沉积斑点的功效，在照射后立即涂抹样品。
在第2、3、6、7和9天重复涂抹实验材料。实验的第8、10天进行色度测量仪读数。所有的E*值都以空白对照部位为基准。这样能更准确的统计试验结果。
结果和讨论
该实验的结果总结在图6中，以总色度反应E*表示。
最开始进行2倍MED的UV-B照射后，皮肤开始一个光刺激反应过程，这时色度主要为红色。到第8天，晒伤反应开始出现，此时颜色是偏褐。观察总色度反应，能够看到试验部位的颜色变得比在晒后立即涂抹2％的曲酸或2％百脉根共生体提取物时的颜色更深。在第10天，该趋势持续，而曲酸和百脉根共生体提取物处理的部位颜色比较浅。
从这些看出，与空白部位相比，2％的曲酸和2％的百脉根共生体提取物对晒伤反应的作用效果相似。在色素沉积实验条件下，2％的曲酸和2％的百脉根共生体提取物都对皮肤的色素沉积具有淡化作用。
结论
基于以上的体外和体内实验数据，可以看出百脉根提取物具有改善皮肤颜色和色调的作用。该作用可能是由于该提取物中存在有强效结合一氧化氮的能力豆血红蛋白，能够与鸟苷酸环化酶竞争。这种提取物很可通过控制cGMP的上调和使蛋白激酶c(PKC)最少化生成(如图3所示)以减缓酪氨酸酶的形成。
总结
总的来说，最近发现人类皮肤中含有一些其他特殊的球型清除蛋白质，特别是近期发现的细胞球蛋白能明显清除一氧化氮和其他活性氧簇的能力。因此豆血红蛋白可作为植物来源的球蛋白应用于个人护理品。
奥麒个人护理品部推广的大豆共生体提取物和百脉根共生体提取物是来自我们即将推出的专利的以豆科植物和其中含有的豆血红蛋白为基础的根瘤提取物系列的最初两种的产品。它们具有强大的束缚一氧化氮的能力。控制一氧化氮自由基能够在预防皮肤中一氧化氮自由基损伤。通过影响一氧化氮的产生，大豆根瘤提取物能够改善皮肤的亚临床红斑，百脉根提取物能够改善皮肤的色素沉积，而这些症状都是由UV引起的。