HPLC法测定青龙衣中胡桃醌的含量

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[摘要]目的：建立高效液相色谱(hplc)对青龙衣中胡桃醌含量测定的方法。方法：色谱柱为：Waters symmetry shieldTM RP18(21 mm×150 mm×3.5 mm)，流动相为甲醇：水（梯度洗脱），流速为0.2 ml/min，紫外检测波长为250 nm。青龙衣烘干粉碎过筛后，采用索氏提取法提取青龙衣中胡桃醌成分，再水浴蒸干加甲醇溶解超声，离心后取上清液，用高效液相色谱法进行含量测定。结果：胡桃醌在1～150g内进样量与峰面积线性关系良好，线性方程为Y= 5891.8X-5679.1，r=0.9982(n=6)。结论：该法灵敏度高，简便快捷，重现性好。

[关键词]高效液相色谱法；胡桃醌；青龙衣

[中图分类号]R91[文献标识码]A [文章编号]1673-7210（2007）04（c）-164-03

青龙衣为胡核桃植物胡核桃（Jugland mand shurica Maxim）和核桃(Juglans regial)的未成熟果皮，主产于山东、河北、东北等地[1]。《山东中草药手册》称之为“青龙衣”后，以后多沿用此名称。国外曾从胡桃类植物提取胡桃醌用于抗癌试验，但未见用于临床。青龙衣辛、苦、涩、平，古人多以其清热解毒、祛风疗癣、止痛止痢功效入药[2]，其有效成分为鞣质、胡桃醌(juglone)、胡桃苷(juglanin)和一些色素[3-4]。现代药用研究表明：青龙衣具有很好的镇痛和抗肿瘤作用，青龙衣粗提物对体外小鼠肉瘤S180细胞有直接杀死作用，其作用与浓度呈正相关[5]，也有资料表明，青龙衣水提物有很强细胞毒性，但其醇提物细胞毒性明显降低，且抗肿瘤活性明显增加[6-7]。

泰山盛产核桃，核桃皮（青龙衣）一直被废弃，其药用价值一直没有得到充分利用，胡桃醌为青龙衣中一种含量高且非常有效的成分[8]。本文建立了高效液相色谱测定青龙衣中胡桃醌含量的方法，为进一步开发利用青龙衣提供了检测技术。

1 仪器与试剂

1.1 试剂与样品

青龙衣，2006年5月30日采于泰山医学院天外村校内，树龄10年以上；胡桃醌标准品购于中国药品生物制品检定所；甲醇为色谱纯（美国Fisher公司）；水为Million-pore（法国产）生成的去离子水；其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器

美国Waters公司ZQ-4000液相色谱-质谱联用仪；Waters2996二极管阵列检测器；Waters symmetry shieldTM RP18色谱柱；循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；KQ2200B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；FW177型中草药粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；Sigma3K30台式离心机（德国产）；索氏提取器。

2 实验方法与结果

2.1 色谱条件

Waters symmetry shieldTM RP18色谱柱，采用甲醇-水为流动相进行梯度洗脱，流速为0.2 ml/min，检测波长为250 nm，柱温为室温，进样方式为自动进样，色谱工作站为Masslynx version4.0色谱处理系统。

2.2 溶液的配制

2.2.1 标准溶液的配制精密称取胡桃醌标准品1.25 mg，用甲醇溶解并于25 ml容量瓶中定容，得胡桃醌贮备液，浓度0.05 mg/ml。精密量取胡桃醌贮备液100 μl、1 ml、2 ml置于10 ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，浓度分别为0.5 μg/ml、5 μg/ml、10 μg/ml。

2.2.2 样品溶液的制备胡桃醌的提取。青龙衣采摘、削皮处理并自然晾干后，于烘箱40℃下烘干至恒重，再进行粉碎，过60目筛，准确称取过筛后样品1 g，用滤纸包裹，置于索氏提取器中，加入120 ml氯仿，90℃水浴加热提取至溶液颜色变淡为止，过滤，用少量氯仿洗涤索氏提取器，过滤并入圆底烧瓶中， 于旋转蒸发仪中50℃水浴蒸干，加甲醇12 ml超声提取10 min，离心机4 000 r/min离心10 min，取上清液，用相同方法再提取2次，上清液合并于50 ml的容量瓶中，用甲醇定容，进样前用0.45 μm微孔有机相滤膜过滤，滤液进行高效液相色谱分析。

2.3 流动相梯度的选择

梯度条件见表1。取2.2.1项下浓度为5 μg/ml的标准溶液，在表1的梯度条件下进行梯度洗脱，进样量为10 μl。其色谱图如图1。

由图1看出，胡桃醌保留时间为21.75 min时出现峰的吸收波长为251.49 nm，与文献报道胡桃醌吸收峰在250 nm左右相接近，故为胡桃醌的最大吸收峰，峰形比较理想。

2.4系统适应性考察

由图1标准品色谱图可知，相同色谱条件下胡桃醌出峰在21.05 min左右，由图2、图3可知流动相纯水和甲醇在21 min左右没有大峰出现，对样品检测产生干扰较小。

样品溶液含有的杂质，影响出峰效果，经提取光谱图，可判断图4 保留时间在21.73 min的峰为胡桃醌的最大吸收峰。计算得胡桃醌的峰分离度为3.6＞1.5，能够完全分离。

2.5 线性关系试验

取胡桃醌标准溶液以5 μg/ml浓度进样，分别进样25、 50、75、100、125、150 μl，记录色谱图，测得数据见表2，以进样量为横坐标，胡桃醌色谱峰峰面积为纵坐标绘制标准曲线（图5）。

在0～150 g范围内线性关系良好，线性方程为Y= 5891.8X-5679.1，r2=0.9965，r=0.9982。

2.6 精密度试验

取浓度为0.02、0.04、0.2 μg/μl样品溶液（低、中、高）按2.2.2项下色谱条件连续进样5次，RSD分别为1.35%、1.24%、0.89%。

2.7 重复性试验

对采集的青龙衣按样品处理方法制备5份样品溶液，在1 d内按2.2.1项下色谱条件重复进样，测胡桃醌的峰面积，代入标准曲线计算，胡桃醌的平均含量为0.26%，RSD=1.23%。

2.8 定量限的建立

取2.2.1项下0.5 μg/ml浓度标准溶液，在相应的色谱条件下，分别进样10、20、30、40 μl，进样量分别为5、10、15、20 ng，记录色谱图，计算出胡桃醌标准溶液定量限。当信噪比S/N=10.04时，胡桃醌标准溶液定量限为5 ng。

2.9 稳定性试验

将样品溶液在一定时间内，测定胡桃醌含量，发现在氯仿中室温放置，72 h内检测，胡桃醌含量稳定；在甲醇中室温放置，24 h内检测，药物含量稳定，1 d后检测，胡桃醌分解。

2.10 加样回收率试验

精密量取已知含量的胡桃醌提取液9份，每份10 ml，分别精密加入1 ml浓度分别为0.5、5、10 μg/ml标准品溶液各3份，余下操作按2.3项下色谱条件进高效液相色谱检测，平均回收率±RSD分别为（98.32±1.36）%、（97.85±2.06）%、（98.16±1.54）%。

2.11 样品含量测定

精密称取同一青龙衣过筛后样品粉末3份，每份1 g，用2.2.2项下的胡桃醌提取方法制备3份样品溶液，配成同种浓度（0.2 μg/l）后，按2.3项下色谱条件进高效液相色谱检测峰面积，代入标准曲线计算胡桃醌含量（表3），计算胡桃醌平均含量为0.26%。

3 讨论

3.1 建立的胡桃醌含量测定的高效液相色谱法方法准确、灵敏度高、测定结果重现性好，且具有定量限低、精密度好、加样回收率高、标准曲线线性关系良好、梯度洗脱条件好的优点。

3.2 青龙衣中胡桃醌平均含量为0.26%。

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