乌司他丁多次给药对延迟心肺复苏大鼠海马谷氨酸含量的干预作用

开篇：润墨网以专业的文秘视角，为您筛选了一篇乌司他丁多次给药对延迟心肺复苏大鼠海马谷氨酸含量的干预作用范文，如需获取更多写作素材，在线客服老师一对一协助。欢迎您的阅读与分享！

DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2014.06.012

基金项目：广东省天普研究基金资助课题（01201040）

作者单位：832002 新疆石河子，石河子大学（姜银松，方琦）；乌鲁木齐总医院 ICU（李新宇）；滨州医学院烟台附属医院急诊科（王占青）

通信作者：李新宇，Email：

心肺复苏成功率不断提高[1-2]，但自主循环恢复（ROSC）后脑复苏质量却不尽人意，心肺复苏的关键取决于脑功能的恢复[3-5]。王姗姗等[6]研究表明乌司他丁（UTI）对心肺复苏后大鼠脑功能的预后有益，但目前动物实验多于心脏骤停（CA）后即刻进行心肺复苏（CPR）， 而患者心脏骤停到实施CPR常需几分钟甚至更长时间；为更接近临床，本实验在大鼠心脏骤停后3 min进行延迟CPR，在ROSC后连续两次给予UTI干预，探讨UTI对延迟复苏大鼠海马的保护作用及机制。

1 材料与方法

1.1 动物、仪器、试剂

健康Sprague-Dawley雄性大鼠110只，8～9周龄，体质量350～450 g，购自新疆维吾尔自治区疾病控制中心动物研究所，饲养于乌鲁木齐总医院动物实验科SPF级动物房；MP50多参数监护仪（德国飞利浦）；HX-200S动物呼吸机（成都泰盟科技有限公司）；milli-Q超低有机物超纯水机制备超纯水（美国Millipore公司）；分析天平（Sartorius，BS 110S，d=0.1 mg）；高效液相色谱仪（美国Waters ）；戊巴比妥钠（上海化学试剂厂）；注射用乌司他丁（广东天普生化医药有限公司，批号：H19990134）；谷氨酸标准品（中国计量科学研究院）；AccQ・Fluor 氨基酸衍生试剂盒（美国Waters 公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 分组 随机数字表法将大鼠分为假手术对照组（S组，n=35）：行麻醉、气管插管及血管穿刺；乌司他丁复苏组（UTI组，n=35）：窒息后常规复苏，ROSC后2 min内和1.5 h经由股静脉推注乌司他丁（10万U/kg）；生理盐水复苏组（NS组，n=35）：ROSC后相同时间推注等剂量生理盐水。复苏组分为ROSC后0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、4 h、6 h 7个亚组，S组气管插管、血管穿刺后同上相同时间点分7个亚组，各亚组5只。

1.2.2 模型制作 本实验参考文献[7]并加以改进。大鼠称质量，3%戊巴比妥钠（35 mg/kg）腹腔注射麻醉，仰卧固定。正中切口，暴露气管，行气管插管。沿腹股沟暴露双侧股动脉鞘，剥离左侧股静脉、右侧股动脉，分别结扎血管远心端，24G套管针向近心端穿刺置管后固定，肝素化（500 U/kg）。连接压力换能器，连接心电肢体导联，至监护仪正常显示股动脉平均动脉压、心电图。伤口处敷蘸生理盐水纱布。稳定10 min后，呼气末气管夹闭诱导窒息（5±1）min致CA，继续延迟3 min[自夹闭气管时计起为（8±1）min]方行常规复苏：开放气道，接小动物呼吸机（呼吸频率80次/min，潮气量6 mL/min），于剑突处胸外按压（频率160次/min），同时经股静脉推注肾上腺素20 μg/kg，观察心电图及平均动脉压变化，ROSC后2 min、1.5 h分别给予UTI组推注乌司他丁，NS组推注等剂量生理盐水。

1.2.3 CA标准 心电图呈室颤、停搏或电机械分离；股动脉平均动脉压

1.2.4 ROSC标准 心电图呈自主节律；股动脉平均动脉压>60 mmHg，持续时间超过10 min；动物皮肤黏膜发绀明显减轻。

1.2.5 退出实验标准 抢救时间超过2 min，自主循环仍无法恢复；虽自主循环恢复，但其后仍有血压下降或心律失常需追加肾上腺素、胸外按压。

1.2.6 药物干预及标本留取 10万单位/安瓿乌司他丁溶于2 mL的0.9%注射用生理盐水，每次推注剂量为10万U/kg。UTI组中的0.5 h、1 h、1.5 h三个亚组在ROSC后2 min内单次推注UTI，2 h、2.5 h、4 h、6 h四个亚组两次推注UTI（ROSC后2 min内+ROSC 1.5 h），按各自设定时间点断头；NS组推注等量生理盐水，余处理同UTI组；S组按设定时间点断头。

1.2.7 检测方法 组织学检测：低温冰台上断头剥离海马后，于4%多聚甲醛中固定24 h。脱水、透明、浸蜡及包埋，海马组织5 μm厚度切片，行HE（Hematein Eosin）染色。反相-高效液相荧光检测：氨基酸对照品配制、衍生试剂配制后，进行氨基酸对照品衍生化反应、大鼠海马组织预处理及衍生化反应，直至进样5 μL进行色谱分析。色谱条件为的流动相A： 称取7.4 g无水乙酸钠，加水930 mL，溶解后用冰醋酸调 pH=6.5，然后加乙腈70 mL，混匀，用0.45 μm滤膜过滤。流动相B：甲醇：乙腈：水=20∶60∶20， 柱温：37 ℃。荧光检测，激发波长235 nm，发射波长395 nm。流速：1.0 mL/min，进样量5 μL。线性梯度洗脱：0 min，0%B；5 min，2%B；10 min，5%B； 12 min，0%B；20 min，100%B。

1.3 统计学方法

数据采用SPSS 17.0统计软件分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析。方差齐性检验采用Levene’s法，方差齐时组间两两比较采用LSD-t法，方差不齐时采用Tamhane’s检验，以P

2 结果

2.1 大鼠海马组织病理形态学观察

光镜下，S组大鼠海马神经元细胞形态、间隙、分布正常。染色质均匀分布，胞核居中，核仁清晰、深染（图1A、D、G）；ROSC后0.5 h，NS组大鼠海马神经元散在分布，细胞间隙变大，存在较多变性、坏死神经元，胞体呈多边形或不规则形，胞核凝固、深染，胞浆溶解（图1B）， 同时刻UTI组变性、坏死神经元较NS组少，细胞形态、分布、间隙稍正常（图1C）；随着ROSC时间延长，到 1.5 h NS组仍有较多变性、坏死神经元（图1E）；UTI组较之损伤神经元不减（图1G）；到ROSC后6 h，NS组神经元排列仍较紊乱、细胞大小不规则（图1H），此时UTI组神经元结构稍正常，变性、坏死神经元很少（图1I）。

A：S组0.5 h；B：Ns组0.5 h；C：UTI组0.5 h；D：S组1.5 h；E：NS组1.5 h；F：UTI组1.5 h；G：S组6 h；H：NS组6 h；I：UTIS组6 h

图1 大鼠海马病理切片（HE×400）

2.2 谷氨酸线性关系及大鼠海马组织谷氨酸含量变化

海马谷氨酸回归方程：y=1.12×105x-3.02×104。NS组与S组相比，复苏后7个时间点谷氨酸含量明显升高（P

A：S组0.5 h Glu含量色谱图；B：NS组0.5 h Glu含量色谱图；C：UTI组0.5 h Glu含量色谱图

图2 大鼠海马谷氨酸液相色谱图

3 讨论

心肺复苏后脑损伤的病理改变及其发病机理是复苏界的研究热点与难点，其病理生理改变呈连锁式反应，脑组织经历了从全脑缺血缺氧期到复苏后再灌注期[8]。脑水肿是脑缺血再灌流过程中一个重要的病理环节，可引发神经细胞功能障碍和、变性、死亡，形成恶性循环直接影响患者的愈合和功能恢复。武军元等[9]发现生理盐水组家猪在心肺复苏后脑组织大部分神经细胞突起消失，细胞明显肿胀，细胞核深染、固缩，尼氏体消失；本课题组杨晴观察大鼠CA后即刻CPR，可见海马细胞变性、坏死[10]。本实验在大鼠CA后3 min行CPR，结果复苏组大鼠在ROSC后0.5 h等多个时间点观察到海马组织细胞变性、坏死，表明本实验大鼠延迟复苏脑损伤模型制作成功。

在CPR脑损伤的发病过程中，谷氨酸迅速释放是神经细胞损伤的启动环节之一。目前认为谷氨酸可能通过激活N-甲基-D-天冬氨酸受体等门控离子通道进一步促进钙钠内流，并且通过与代谢型谷氨酸受体作用激活G蛋白等缺血中间环节，最终导致细胞损伤。本课题组前期研究显示ROSC后0.5 h，UTI组和NS组大鼠海马组织中谷氨酸含量与S组相比均明显升高（P

本实验发现，与S组比较，NS组、UTI组大鼠的海马谷氨酸含量在ROSC后0.5 h等多个时间点明显升高（P

UTI是一种高效广谱的酶抑制剂[12]，在缺血-再灌注打击过程中对脏器发挥积极的保护作用[13-14]，本实验中谷氨酸在复苏后0.5 h、2 h、2.5 h、4 h、6 h浓度不程度降低，差异具有统计学意义（P

参考文献

[1]Wang S， Wu JY， Li CS. Load-distributing band improves ventilation and hemodynamics during resuscitation in a porcine model of prolonged cardiac arrest[J].Scand J Trau Resus & Emerg Med，2012，20（59）：1-9.

[2]Yannopoulos D，Matsuura T，McKnite S，et al.No assisted ventilation cardiopulmonary resuscitation and 24-hour neurological outcomes in a porcine model of cardiac arrest[J].Crit Care Med，2010，38（1）：254-260.

[3]Wang W，Ye SD，Zhou KQ，et al.High doses of salicylate and aspirin are inhibitory on acid-sensing ion channels and protective against acidosis-induced neuronal injury in the rat cortical neuron[J].J Neurosci Res，2012，90（1）：267-277.

[4]Nichol G，Aufderheide TP，Eigel B，et al. Regional systems of care for out-of-hospital cardiac arrest：a policy statement from the American Heart Association[J].Circulation，2010，121（5）：709-729.

[5]余涛，唐万春.心肺复苏50年，我们学到了什么？[J].中华急诊医学杂志，2013，22（1）：6-8.

[6]王姗姗，陈寿权，李章平，等.乌司他丁对心肺复苏后大鼠脑水肿和血脑屏障的作用[J].中华急诊医学杂志，2006，15（4）：338-340.

[7]陈寿权，李章平，干姗姗，等.窒息法致大鼠心脏骤停模拟复苏的影响因素[J].中华急诊医学杂志，2005，14（10）：814-817.

[8]Krep H，Brinker G，Pillekamp F，et al . Treatment w ith an endothelin type A recept or-antagonist after cardiac arrest and resuscitation improves cerebral hemodynamic and funct ional recovery in rats [ J].Crit Care Med，2000，28 （ 8）：2866-2872.

[9]武军元，王烁，李春盛，乌司他丁对心肺复苏后家猪脑功能的保护作用[J].中华急诊医学杂志，2013，22（1）：18-22.

[10]杨晴，李新宇，王晓燕，等.乌司他丁对大鼠心肺复苏后早期血清S100B蛋白和NSE的影响[J].中国急救医学，2011，31（12）：1092-1095.

[11]张莉，李新宇，王晓燕，等.乌司他丁对大鼠心肺复苏后早期海马兴奋性氨基酸的影响[J].中国急救医学，2013，33（4）：843-847.

[12]卢俊英，王育珊，刘德新，等.乌司他丁干预治疗对复苏后多器官功能障碍综合征防治效果的临床观察[J].中国急救医学，2009，29（12）：1084-1087.

[13]Chen H，He MY，Li YM.Treatment of patients with severe sepsis using ulinastatin and thymosin alphal：a prospective，randomized，controlled pilot study[J].Chin Med J（Engl），2009，122（8）：883-888.

[14]张坚，闫圣涛，郭诗东，等.乌司他丁与1，6 二磷酸果糖对脑缺血-再灌注谷胱甘肽过氧化物酶和丙二醛影响[J].中华急诊医学杂志，2007，16（ 6）：619-621.

[15]Ozawa S. Role of glutamate transporters in excitatory synapses in cerebellar Purkinje cells[J] Brain Nerve，2007， 59（7）：669-676.

[16]李仕军，闻飞英. 乌司他丁对严重脓毒症患者血乳酸及乳酸清除率的早期影响[J/CD]. 中华危重症医学杂志：电子版，2013，6（2）：98-101.

[17]李国民，万健，袁冬，等. 乌司他丁对重型创伤性脑损伤患者颈内静脉血乳酸的影响[J/CD]. 中华危重症医学杂志：电子版，2012，5（2）：95-99.

（收稿日期：2014-02-04）

p657-660