454高通量测序技术在土壤微生物中的应用

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摘要：指出了土壤微生物是土壤的重要组成部分，在土壤有机物质分解和养分释放、能量转移等生物地化循环中起着重要作用。土壤微生物的种类繁多，一直在研究中。从最初的平板培养法到现在的高通量测序法，对土壤微生物的研究技术发生了巨大的变化。技术在一点一点改进，结果越来越准确。高通量测序现在能一次对成千上万条DNA进行测序，可以很大程度地减少时间和技术成本。在简要阐述454高通量测序技术的基础上，着重讨论了新一代测序技术在土壤微生物中的应用。

关键词：土壤微生物；高通量测序；生物多样性

中图分类号：S154.37文献标识码：A文章编号：16749944（2013）08020303

1引言

土壤是一个非常复杂的生态环境体系，土壤微生物学作为微生物学的一个分支，一直在研究之中。土壤微生物是土壤的重要组成部分，是生态系统中重要的消费者和分解者，其群落结构多样性及变化在一定程度上反映了土壤的质量和稳定性。土壤微生物多样性是指微生物生命的丰富性及在遗传、种类、生态系统层次上的变化，同时反映微生物群落的稳定性。许多研究已经证实， 通过传统的DNA分离方法测定出来的土壤微生物只占到环境微生物的0.1%～10%[1， 2]。传统的土壤微生物研究方法如微生物平板培养法、Biolog鉴定系统法、生物标记法等[3]往往会过低估价土壤微生物的群落结构组成，无法详细描述出土壤微生物的群落结构组成方面的信息，也无法描绘出不同群体的生理差异。随着科学技术的发展，传统的Sanger技术的弊端也日益体现，一方面是因为该方法费时，且一次的反应数有限，另一方面是该技术基于酶法测序，成本较高。随着微生物研究技术的迅速发展尤其是分子生物学技术的发展，土壤微生物学研究专家开发出一系列的研究土壤微生物群落结构的方法[4]，高通量测序技术也随之诞生，慢慢应用到科研之中。

2土壤微生物研究方法

2.1微生物平板培养法

传统的土壤生态系统中微生物群落多样性及结构分析大多是将微生物进行分离培养，然后通过一般的生物化学性状，或者特定的表现型来分析，局限于从固体培养基上分离微生物。这种方法只能培养出极少量的微生物类群，大约占0.1%～10%，无法对绝大多数土壤微生物的分类和群落结构进行深入研究。因此这种培养法局限性比较大，只能应用于特殊微生物的研究[5]。

2.2BIOLOG鉴定系统

BIOLOG系统是Garland于1991年建立起来的一套用于研究土壤微生物群落结构和功能多样性方法。细胞的维持和生长需要能量、碳源和多种无机离子，底物利用是群落中微生物存活和竞争的关键。因此可以根据微生物对碳源利用的方式来鉴定微生物的群落结构。碳数利用法通常用BIOLOG盘来实现。BIOLOG测试盘内有96个小孔，除了一个小孔为对照不含碳源外，其余都含不同的碳源。试验中将碳源和指示剂一起放入平板小孔内，然后将稀释后的细胞悬液接种到各个小孔中，由于微生物利用碳源引起指示剂变化，以此来检测和判断不同土壤微生物群落结构[6]。

2.3分子生物学技术测序方法

在过去的20多年里，分子生物学技术尤其16S rDNA技术已经广泛应用于鉴定未知菌类的研究中。20世纪80年代以来，逐步建立起了以分子系统发育分析为基础的现代微生物分子生态学的研究方法，如PCR-RFLP、PCR-RAPD、PCR-SSCP、荧光原位杂交技术（FISH）、基因芯片（Microarry）、磷脂脂肪酸图谱分析（ Phospholipid fatty acid， PLFA）、稳定同位素探针（Stable Isotope Probing， SIP）、PCR-DGGE/TGGE等[7]，使得研究者能够在分子水平上对土壤微生物多样性进行研究。

但是这些技术只能在科或属水平上分析土壤微生物的群落结构，不能更细致更详细地对土壤微生物进行分析研究。随着科学技术的发展，相继出现了第一代、第二代、第三代高通量测序技术，使得研究人员能在种的水平上对土壤微生物进行研究和分析。

2.4 454高通量测序方法

高通量测序技术[8]是传统测序一次革命性的改变，一次可以对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，在有些文献中也称其为下一代测序技术（next generation sequencing），可见其划时代的改变，同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序。

近年来，以16S rRNA/DNA为基础的分子生物学技术已成为普遍接受的方法。研究表明，400～600碱基的序列足以对环境中微生物的多样性和种群分类进行初步的估计[9]，因此454高通量测序的方法因其读长（400～500bp）长和准确性高的特点大量用于微生物多样性的研究。

因此通过高通量测序法来确定土壤微生物群落结构，从而可以在种的水平上将土壤微生物的群落结构分析出来，然后就可以对土壤微生物的多样性进行分析。并可以对土壤微生物和盐生植被的相互照应关系进行分析研究。

3454高通量测序在土壤微生物研究中的应用

3.1研究土壤微生物的物种多样性

研究微生物物种多样性主要从微生物类群即细菌、真菌和放线菌这三大类群的数目及其比例来描述某个地区某段深度土壤中微生物的多样性，然后根据此地区土壤微生物物种的多样性来探究全球范围内土壤微生物的物种多样性。通过高通量测序测得土壤中土壤微生物的各种菌类组成，以此来研究某个地区土壤中微生物的物种多样性。

3.2研究土壤微生物的功能多样性

研究土壤微生物功能多样性主要从各种微生物的活性及它们的相互作用产生的功能、底物代谢能力及与N、P、K等营养元素在土壤中相互转化的功能等。通过将高通量测序得到的土壤微生物的群落结构及组成和实验测定土壤的几种理化性质及转化过程来了解土壤微生物的功能。

通过实验测得土壤的碱解氮、有效磷、活性有机质、腐殖质理化性质，可以分析地区土壤微生物的功能多样性，以此来探究全球范围内土壤微生物乃至整个微生物的功能多样性。

3.3研究环境的突然变化对土壤微生物菌群的影响

环境的突然改变会导致微生物群落的结构和功能发生变化。近几年来随着全球变暖，土壤微生物的群落结构可能发生了变化，地震、泥石流等自然灾害也会对土壤微生物的群落构成产生影响。Zachary等以重水稳定同位素探测技术（H218O-SIP）鉴定与土壤增湿相关的细菌。先对土壤增湿前土壤微生物进行测定，得到土壤微生物各种组成，然后将土壤增湿后，对土壤中16S rRNA进行高通量测序，发现Alphaproteobacteria、Betaproteobacteria和Gammaproteobacteria的相对比例升高，而Chloroflexi和Deltaproteobacteria的比例则降低。作者通过控制土壤湿度的动态变化，对微生物菌群的结构发生变化进行研究，划分生态类群。除此之外，温度的骤变也会对土壤微生物菌群产生巨大的影响。

4454高通量测序技术存在的问题及发

展前景到目前为止，大量的研究者应用454测序技术对多种环境样品的微生物多样性进行了深入研究，这些研究大大增长了人类对微生物的存在和种类的认识。针对不同的研究对象，454测序技术不仅为研究提供了大量数据，证实研究对象所含微生物具有较高的多样性，而且还建立了一种研究复杂生态系统里的微生物多样性方法。但由于该技术刚刚起步，所以存在一些待解决的问题。首先，随着核酸序列数量上的跨越式累积，生物信息学分析将面临巨大的挑战。另外，海量数据的深入挖掘工作会发现用传统生物学理论难以解释的生命规律，对传统理论的颠覆和新理论的提出与建立将成为不可避免的工作。

虽然存在许多不足，但454测序技术仍以其强大的测序能力渗透到生命科学研究的方方面面，包括那些此前无法用测序来解决的领域。在微生物领域，凭借着 454测序技术各方面的优势，终究会成为未来研究环境基因组的主导测序技术，同时，随着454技术的不断完善，该技术将为微生物生态学研究注入新的动力，成为微生物生态学研究新的亮点，大大加速微生物生态学的发展，增长人类对微生物生态学的认识，为人类探索广袤的微生物资源提供无限遐想。参考文献：

[1]Amann RI， Ludwig W， Schleifer KH. Phylogeneticidentification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation[J]. Microbiol. Rev.， 1995， 59 （1）： 143～ 169.

[2]Brock TD. The study of microorganisms in situ： progress and problems[J]. Symp. Soc. Gene Microbiol.， 1987， 41：1～17.

[3]Zhang X， L Z J ，Ch Z H. Soil microbial diversity research methods [J]. Journal of anhui agricultural sciences， 2007，35（32） ：10373 ～10375.

[4]Lu P， electronic leaching， W H Y， et al. Molecular biotechnology application in soil microbial diversity change [J]. Journal of clean coal technology，2009，15（6） ：106 ～109.

[5]Huang Yanxia. Research progress on soil microbial diversity analysis technology [J]. Journal of anhui agricultural sciences，

[6]Ferris M J ， Muyzer G， Ward D M. Denaturing gradient gel electrophoresis profiles of 16S rRNA defined populations inhabiting a hotspring microbial mat community[J] . Appl Environ Microbiol ， 1996 ，62 ：340～346

[7]Sultan M，Schulz M H，Richard H，et al.A global view of gene activity and alternative splicing by deep sequencing of the human transcriptome[J]. Science，2008，321（ 5891） ： 956～960.

[8]Schuster S C. Next-generation sequencing transforms today’sbiology[J]. Nat Methods，2008，5（ 1） ： 16～18.

[9]Chen Qiubo， LiuXiaoXiang. Climate change effects on soil microorganisms [J]. Journal of tropical agricultural sciences， 2004，