叶绿素铜钠盐的制备与分析检测

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[摘要]叶绿素类色素主要包括叶绿素及其衍生物，高等植物和藻类中包含大量的叶绿素，本文在前期提取蓝藻叶绿素的基础上，研究了叶绿素铜钠盐的制备条件并分析了其结构，结果表明：温度60℃、时间40min以上时皂化较彻底；酸化置铜pH1-2、温度50℃、时间超过60min铜化较彻底，再成盐结晶得到叶绿素铜钠盐，得率为1.91%；通过HPLC、UV、LC/MS等方法，分析测试所得到的叶绿素铜钠盐并进行结构鉴定，得出Cu chlorin p6为叶绿素铜钠盐主要成分，根据它的分子结构和产生的分子离子峰碎片，推测分析了其电离机理。

[关键词]叶绿素铜钠盐 制备 分析检测

蓝藻为原核生物，又称蓝绿藻或蓝细菌。蓝藻是所有藻类生物中最简单、最原始的一种光合放氧生物，蓝藻在地球表面从无氧的大气环境变为有氧环境过程中起了巨大的作用，蓝藻中含有丰富的藻胆蛋白、天然色素、多糖、油脂等，因此综合利用蓝藻成为近年来开发研究的热点，其中研究得最为广泛为蓝藻中的叶绿素。叶绿素类色素主要包括叶绿素及其衍生物，高等植物和藻类中包含大量的叶绿素[1]。叶绿素类似物中的卟啉环结构类似人体血红素结构，可促进创伤和溃疡愈合、活化细胞、抗贫血、抗菌消炎等多种活，同时它也能预防心血管疾病、护肝以及抗衰老；研究表明，叶绿素能有效抑制多环芳烃类的诱变作用，对抑制癌细胞生成也有一定的效果[2]。叶绿素衍生物也得到较为广泛的应用，如叶绿素铜钠可作食品添加剂和日用化工的染色剂[3]、脱臭剂[4]，且还可用来制造光敏剂[5]、汽油和涂料的添加剂等，叶绿素铜钠盐还可作为医药原料起到保肝、护胃、抗贫血的作用[4]，对传染性肝炎、十二指肠溃疡、慢性肾炎、胰腺炎、以及白血病等疾病有一定的疗效[6]。本文在提取蓝藻叶绿素的基础上，研究了叶绿素铜钠盐的制备并对其结构进行了分析。

一、材料与方法

（一）材料与试剂

干蓝藻取自无锡某公司：新鲜蓝藻脱水后再喷雾干燥，4℃冰箱储存。

甲醇 （色谱纯）、乙腈 （色谱纯） 购于Tedia公司；叔丁基甲醚 （色谱纯）、四甲基硅烷 （NMR级）、氘代氯仿 （NMR级）购于Sigma公司；二甲亚砜 （AR）、氯化钴 （AR）、3% H2O2 （AR） 购于国药集团化学试剂有限公司。

（二）实验方法

1.叶绿素的浓缩

提取夜抽滤分离残渣，各次滤液合并，减压浓缩至原体积的1/5左右，回收溶剂以供循环使用。

2.叶绿素的皂化

不同质量的NaOH加入叶绿素-a含量不同的提取液中，用不同的水浴温度下皂化提取液，皂化是否完成用石油醚检测[7]。

3.叶绿素铜钠盐的萃取

提取液皂化结束后，把冷却后的皂化液移入分液漏斗中，加入一定体积的石油醚，充分振荡，静止分层，下层为叶绿素盐皂化液深绿色，上层为棕黄色液体。收集下层并加石油醚反复提取直至醚层为无色或者浅淡黄色。

4.酸化置铜

萃取完毕后，在下层叶绿素皂化液中加入相同体积的盐酸，同时不断搅拌溶液，调pH值，再根据叶绿素分子中所含镁离子理论量加入1.5-2.0倍铜离子[8]，于不同水浴温度下铜化，铜化效果以溶液中游离铜的量来确定。

5.成盐

铜化液抽滤，用蒸馏水反复洗涤残渣至滤液为无色，45℃烘干滤饼，溶于1：1乙醇丙酮的混合液中，用5%NaOH 乙醇溶液调pH至有沉淀产生，抽滤带有结晶沉淀液并用乙醇洗涤2-3次，45℃烘干，获得有金属光泽的叶绿素铜钠盐。

（三）叶绿素铜钠盐的分析与检测

1.叶绿素铜钠盐全波长扫描

紫外可见分光光度计在波长范围190-700nm中检测叶绿素铜钠盐溶液。

2.叶绿素铜钠盐的HPLC检测[9]

色谱柱：YMC（C30， 3μ，250×4.6 mm）；DAD检测器，紫外检测波长：405nm；

洗脱条件：W（A）=0%-50% 30min，W（A）=50%-100% 10min，W（A）=100% 5min，W（B）=100%-0% 5min；流动相A [V（甲醇）：V（水）：V（醋酸）=90：10：0.5]；流动相B [V（叔丁基甲醚）：V（甲醇：V（醋酸）=100：10：0.5）]；柱温：30℃；流速1 mL/min；进样量：10μL。

3.叶绿素铜钠盐的质谱分析

MALDI SYNAPT Q-TOF MS条件： 电喷雾正离子源（ESI+）条件：锥空电压30V，毛细管电压3.5kv，检测器电压 1600V，脱溶剂氮气流速500L/h，离子源温度100℃，脱溶剂温度250℃，碰撞能量20eV，锥孔气体流速50L/h，采集范围50-1000m/z。数据采集、分析软件采用MassLynx-V4.1。

4.叶绿素铜钠盐产品检测（QB 3783-1999）及藻毒素的检测[10]

二、结果与讨论

（一）叶绿素铜钠盐的制备

1.皂化温度的选择

将提取液用NaOH-乙醇液调pH值到12，分成相同的若干份，分别在60℃、65℃、70℃皂化，皂化时间相同，皂化结果见表1。实验表明：温度为60℃，皂化时间40min以上时皂化较彻底。

2.皂化碱用量的选择

在提取叶绿素的过程中，也会将蓝藻中其它成分提取出来，这样皂化液中含有大量的类胡萝卜素、有机酸以及脂质物质等杂质。当叶绿素皂化时其它杂质也会发生皂化水解、中和等反应，这将消耗很大一部分NaOH，又由于皂化反应是一种动态平衡反应，当反应达到平衡时水解速度和酯化速度相等，当增加NaOH浓度，平衡反应被打破，有利于向我们需要的方向反应进行。因此考察碱NaOH的用量是按理论量的20-100倍加入，在60℃皂化相同时间比较其皂化效果，实验结果见表2。结果表明：皂化温度60℃，时间40min以上，加碱量为理论量的40倍以上时，皂化较彻底，考虑到加碱量过大以及后续酸化置铜加盐酸调酸性时会耗酸较大而导致的工艺成本提高，选择加碱量为理论量的40-60倍为宜。

表1：温度和时间对皂化反应的影响

﹣：表示醚层为黄绿色；+：表示醚层为黄色

表2 碱用量对皂化反应的影响

--：表示醚层为绿色；-+：表示醚层为黄绿色

+：表示醚层为黄色；++：表示醚层为棕黄色

3.萃取

将皂化液冷却后移入分液漏斗中，加入一定体积的石油醚充分振荡，静止分层，上层呈棕黄色为叶绿素类物质，下层为深绿色皂化液，主要包括类胡萝卜素、脂质等杂质，移去上层溶液，并经石油醚反复萃取，直至上层为浅淡黄色为止。

4.酸化铜化工艺条件的选择

pH、温度、时间以及铜的加入量是影响酸化铜化工艺的主要因素。前人研究表明，酸化铜化一般按理论量1.5—2倍的铜加10% CuSO4）[8]，其它三个因素对铜化的影响可以通过溶液中游离铜的含量来确定，溶液吸光度越大，表明其游离铜越多，置铜不完全。实验结果如图1。从图1A可知，当pH值升高时游离铜含量也增加，在pH1—2时游离铜含量较少，考虑到酸度太高易引起叶绿素破坏以及后续成盐过程中要加NaOH调pH，所以选择pH1—2进行铜化；从图1B和C可知，当反应温度提高时，生成的叶绿素铜酸也逐渐增加，这主要是由于温度升高，分子热运动加快，有利于提高反应速率。当温度在50℃以上，铜化时间超过60min的情况下，游离铜的吸光值基本趋于一致，因此温度和时间分别选择为50℃和60min来铜化，在此条件下可保证铜化完全，此时溶液呈墨绿色，并有铜酸沉淀生成。

将所得叶绿素铜酸抽滤，并用蒸馏水反复洗涤以除去水溶性杂质，此时应注意要尽量彻底除去CuSO4，如不能彻底除去它，不但在成盐过程中会生成氢氧化铜沉淀，影响产品纯度和产率，导致产品中游离铜含量过高，从而达不到食品添加剂QB 3783-1999的要求。

图1：pH、温度和时间对铜化工艺的影响

5.成盐

在1：1丙酮乙醇的混合液中加入已过滤的叶绿素铜酸，边搅拌边加入5%的NaOH乙醇溶液调pH值，一般在pH12左右时，将会有晶体产生，此时停止加碱，结晶完毕并抽滤，将产品放入80℃的恒温干燥箱中干燥，得到墨绿色有金属光泽的叶绿素铜钠盐。

（二）叶绿素铜钠盐的分析检测

1.叶绿素铜钠盐的特征吸收

经过双蒸水溶解的叶绿素铜钠盐样品，在U-3000Spectrophotometer型全波长扫描仪下190—800nm波长内扫描，结果见图2。图中显示在紫外光199nm以及可见光405nm和630nm下叶绿素铜钠盐溶液有三个特征吸收峰，选择可见光吸收峰λmax=405nm测定叶绿素铜钠盐溶液吸光度。

图2：SCC紫外可见吸收光谱图

2.叶绿素铜钠盐HPLC及质谱图

因叶绿素是一种二元酸酯，在皂化过程中不仅发生酯化反应，而且会破坏侧环，因皂化工艺上的差别导致叶绿素铜钠盐分子结构形式不同，存在着十几种类似物。一些研究发现在碱性条件下制备叶绿素铜钠盐主要以Cu chlorin p6形式存在[11]。从图3可看出出峰时间为18.9min是主要物质；对其进行质谱分析。

图3：叶绿素铜钠盐的HPLC图谱

图4：叶绿素铜钠盐的质谱图

Cu在自然界中存在同位素，65Cu占的比例为31%，而63Cu为69%。从图4可以看出主要正离子峰的丰度（M+2）/M值在50%左右，可以推断出其离子峰为Cu的同位素峰。Mortensen[9]等研究认为只有Cu chlorin p6质谱图上才有m/z为643的离子峰，而其它叶绿素铜钠盐都没有；图4中离子峰m/z=643占100%，因此可以推断此物质分子离子峰[M+1]=643，分子式模拟质谱图Cu chlorin p6发现分子离子峰m/z也为643，其同位素峰的丰度比以及峰形与实际质谱图极其相似，同时高效液相紫外扫描检测到该物质的紫外特征吸收波长为634nm和406nm，与文献报道相一致。因此通过该物质分子特征吸收峰和离子峰可以推断出从蓝藻中萃取叶绿素-a制备的叶绿素铜钠盐主要以Cu chlorin p6为主，其分子式为C33H29O6N4CuNa3，分子结构如图5。根据主要的碎片离子峰m/z为625、600、582、556、538、526等，对其电离机理推测分析如图6。

图5：Cu chlorin p6的结构图

图6：Cu chlorin p6 的质谱电离机理分析

（三）叶绿素铜钠盐的成品检测

叶绿素铜钠盐质量检测按照QB3783-1999方法进行，结果见表3。经检测产品主要项目指标均符合，而且未检测出藻毒素。

表3：叶绿素铜钠盐产品质量指标表

三、结论

1.叶绿素铜钠盐的制备工艺：皂化温度60 ℃、时间40min以上时皂化较彻底；pH1—2以及温度50 ℃、时间60min以上时铜化较彻底，再结晶得到叶绿素铜钠盐，其得率为1.91%；通过UV、HPLC、LC/MS等方法确定了该工艺制备的叶绿素铜钠盐主要成分为Cu chlorin p6，并对其电离机理进行了推测分析。

2.叶绿素铜钠盐质量检测指标符合QB 3783-1999，而且未检测出藻毒素。

[参考文献]

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[3]Mortensen A，Geppel A.HPLC-MS analysis of the green food colorant sodium copper chlorophyllin[J].Innovative Food Science&Emerging Technologies.2007，8（3）：419-425.

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（作者单位：江西省修水县散原中学 江西修水）