蓖麻籽蛋白质的粗分离

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摘要：以蓖麻籽中总蛋白为研究对象，对磷酸盐法提取蓖麻籽中粗蛋白过程进行优化。结果表明，在硫酸氨饱和度为70%时对蓖麻籽中粗蛋白的提取效率最高；利用优化后的磷酸盐法对7个不同发育时期的蓖麻籽中的蛋白质进行粗提取，并利用紫外分析法对所提取的不同生长阶段的蓖麻籽中的粗蛋白进行比较分析，结果发现自植株授粉后到获取蓖麻籽的时间间隔越长蓖麻籽中总蛋白积累量就越高。

关键词：蓖麻籽；蛋白质；提取

中图分类号：S565.601文献标识号：A文章编号：1001-4942（2013）02-0110-03

蛋白质的提取方法有很多，目前文献已报道过的蛋白质提取方法主要有水溶液提取法、有机溶剂提取法以及酶法和超声波萃取法等[1～5]。蓖麻（Ricinus communis）在国内种植广泛，资源丰富。为进一步加深对蓖麻籽中酶的研究和利用，本实验利用磷酸缓冲液（PB）法提取蓖麻籽蛋白质，并对盐析浓度进行优化，同时利用优化后的提取方法对在不同发育时期的蓖麻籽粗蛋白进行提取并比较分析。

1材料与方法

1.1材料

成熟通蓖五号种子，通辽巨大种业公司提供。

种植在实验田的哲蓖四号经人工授粉后采集分期蓖麻种子，授粉当天为0 DAP（Days after pollination），授粉第二天为1 DAP；分别采集哲蓖四号同一植株上16、23、30、37、44、51、69 DAP共7个不同时期的种子，采集后立即去壳并放入超低温冰箱中。

1.2主要仪器

高速冷冻离心机，珠海黑马医学仪器有限公司；DYY-6C型电泳仪，北京市六一仪器厂；精密pH计，上海精密科学仪器有限公司；电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；SHA-B数显恒温振荡器，常州国华电器有限公司；T6新世纪紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司。

1.3蓖麻籽粗蛋白提取方法的优化

参照曾佑炜等[6]的方法并稍作修改。

从超低温冰箱中取出去壳的通蓖五号蓖麻籽适量，放入冷冻好的研钵中迅速研磨。充分研磨后称取8.0 g放入50 ml的离心管中，加入5 mmol/L 磷酸缓冲液（PBS，pH 6.5，含100 mmol/L NaCl，缓冲液A）32 ml，并充分混匀，4℃放置过夜。4℃、14 000 r/min离心30 min，小心去除沉淀和白色脂肪，取上清于另一离心管中，相同条件下重复离心1次。取7个1.5 ml的离心管，将所得上清液各取1 000 μl，分别加入不同质量的固体硫酸铵，使各管的硫酸铵浓度依次为30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%，4℃放置过夜。4℃、17 000 r/min离心30 min，弃去上清，取500 μl缓冲液A将沉淀溶解。

1.4粗蛋白的电泳检测

将得到的蓖麻粗蛋白提取物进行SDS-PAGE检测。浓缩胶的浓度为5%，分离胶浓度为12%。分别将上述所得的蓖麻粗蛋白提取液取样100 μl，加入25 μl的5×蛋白缓冲液混匀，沸水中煮沸5 min，12 000 r/min离心5 min，取上清25 μl点样，电泳，经染色及脱色后观察。

1.5粗蛋白含量的测定

利用紫外分光光度计对蓖麻籽中的蛋白含量进行测定。将各管提取样液20倍稀释后，在280 nm和260 nm处分别测出其吸光值（A值），然后利用280 nm及260 nm下的吸收差来求出蛋白质的浓度[7]。

蛋白质的浓度 （mg/ml） =1.45A280-0.74A260

1.6利用优化后方案提取哲蓖四号蓖麻籽粗蛋白并检测

分别将采集的不同发育时期蓖麻种子经充分研磨后，称取0.25 g样品放入1.5 ml离心管中，依据料液比为1∶4的比例，每管分别加入1 000 μl的缓冲液A。依据上述粗蛋白提取方法提取粗蛋白并溶解于500 μl缓冲液A中，利用紫外分光光度法测定粗蛋白含量，同时进行SDS-PAGE电泳检测。

2结果与分析

2.1蓖麻籽中总蛋白粗提优化体系的确定

2.1.1紫外法检测分析所提通蓖5号蓖麻籽中粗蛋白含量的结果由图1可以明显看出，在硫酸铵饱和度为70%时对蓖麻籽中蛋白质的粗提效果最佳；粗蛋白提取量在硫酸铵饱和度为40%～50%之间的增率最大，而其他各梯度之间的差率跨度并不是太大。