黄芩水煎液及联合硫酸庆大霉素对铜绿假单胞菌生物膜的体外影响

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摘要：

目的： 研究黄芩水煎液体外对铜绿假单胞菌生物膜的影响及其与硫酸庆大霉素的协同杀菌效果。 方法： 采用对倍稀释法和MTT法检测黄芩水煎液对铜绿假单胞菌最低抑菌浓度（MIC）及其生物膜MIC（SMIC）的作用，及其与硫酸庆大霉素协同的效果。 结果： 黄芩水煎液对铜绿假单胞菌的MIC为1.95mg/ml， SMIC为31.25mg/ml，黄芩水煎液浓度在3.93mg/ml或以上时硫酸庆大霉素有明显的抗菌协同作用。 结论： 黄芩水煎液体外对铜绿假单胞菌生物膜的形成有较为明显的抑制作用，与硫酸庆大霉素联合用药有一定的抗菌协同作用。

关键词：黄芩水煎液；铜绿假单胞菌；生物膜

【中图分类号】

R917 【文献标识码】B 【文章编号】1002-3763（2014）07-0072-01

1 前言

铜绿假单胞菌是引起粘膜和创伤感染最常见的革兰氏阴性菌，其极易形成生物膜，产生耐药性。在国内研究表明，清热解毒药物中的某些药物对治疗慢性感染有较好的效果。为了更多的发掘出抗铜绿假单胞菌生物膜的药物，本课题从清热解毒药物中选取黄芩，研究其对铜绿假单胞菌生物膜的影响，以及与抗生素合用的协同作用，为黄芩抗铜绿假单胞菌生物膜和联合硫酸庆大霉素用药提供实验依据。

2 材料与仪器

2.1 材料：铜绿假单胞菌1株，由安徽中医学院微生物与免疫教研室于临床分离获得，并经鉴定。黄芩100 g，购于国泰大药房。水煎2次，合并浓缩成50%浓度药液（含生药500mg/ml）。硫酸庆大霉素注射液，80mg/2ml（湖北同济奔达鄂北制药有限公司）。胰酶大豆肉汤（杭州微生物试剂有限公司）。四甲基偶氮唑盐（MTT，Sigma公司），二甲基亚砜（DMSO，天津市光复精细化工研究所，分析纯）。

2.2 检测仪器：318酶标仪（上海三科仪器有限公司），96孔微量培养板（杭州生友生物技术有限公司），DPH-9162型电热恒温培养箱（上海一恒科技有限公司）。倒置显微镜（OLYMPUS C×41）

3 方法

3.1 细菌计数：菌落计数法测定细菌浓度：2.98×1014CFU/ml；调整浓度至2.98×105 CFU/ml、2.98×109 CFU/ml，备用。

3.2 黄芩水煎液对铜绿假单胞菌MIC的测定：依据NCCLS 的M27- A 方案[3]，将黄芩水煎液以胰酶大豆肉汤稀释成10个浓度梯度：500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.87、3.93、1.95、0.98 mg/ml，分别加入96孔板，100μl/孔，每个浓度8个复孔。加入调整至2.98×109CFU/ml菌体的混悬液100μl，37℃培养48h，接种于无菌固体培养皿中，37℃培养24h，以无菌生长的最小药物稀释度作为铜绿假单胞菌的MIC。

3.3 黄芩水煎液对铜绿假单胞菌SMIC：将100μl调整至2.98×105CFU/ml的细菌悬浮液分别加入96孔板，37℃培养48h，使铜绿假单胞菌完全粘附于平底的96孔板表面，形成铜绿假单胞菌生物膜的结构。生物膜形成后，弃去培养基及悬浮菌，用PBS洗3次，将黄芩水煎液以胰酶大豆肉汤稀释成10个浓度梯度：500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.87、3.93、1.95、0.98 mg/ml，分别加入96孔板，100μl/孔，每个浓度8个复孔。继续培养48h，倒置显微镜下观察其形成情况。MTT法检测抑制生物膜的药物浓度：即50μl的MTT溶液（ 贮存液含5mg/ml PBS， 临用前用预温的0.15M PBS 按1∶5 稀释） 加入每孔中， 37℃孵育5h。弃去含MTT 的培养基， PBS 洗3 遍， 加入DMSO 100μl， 振荡5min， 在酶标仪492nm 波长下检测吸光度。设未加药孔为空白对照。

3.4 硫酸庆大霉素对铜绿假单胞菌MIC的测定：将硫酸庆大霉素注射液以胰酶大豆肉汤稀释成10个浓度梯度：125、62.5、31.25、15.63、7.81、3.91、1.95、0.98、0.49、0.25μg/ml，分别加入96孔板，100μl/孔， 每个浓度8个复孔。加入调整至2.98×105CFU/ml菌体的混悬液，100μl/孔。37℃培养48h， 接种于无菌固体培养皿中，37℃培养24h，以无菌生长的最小药物稀释度作为铜绿假单胞菌的MIC。

3.5 黄芩水煎液联合硫酸庆大霉素对铜绿假单胞菌的MIC：将黄芩水煎液以胰酶大豆肉汤稀释成10个浓度梯度：500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.87、3.93、1.95、0.98 mg/ml，分别加入96孔板，50μl/孔， 每个浓度8个复孔。加入浓度调整为0.98μg/ml的硫酸庆大霉素注射液，50μl/孔。加入调整至2.98×109CFU/ml菌体的混悬液100μl，37℃培养48h， 接种于无菌固体培养皿中，37℃培养24h，以无菌生长的最小药物稀释度作为铜绿假单胞菌的MIC。观察其是否有抗菌协同作用。

4 结果

4.1 黄芩水煎液、硫酸庆大霉素、黄芩水煎液联合硫酸庆大霉素对铜绿假单胞菌MIC：

由表1可知，黄芩水煎液与硫酸庆大霉素联合用药有一定的抗铜绿假单胞菌协同作用。

4.2 黄芩水煎液对铜绿假单胞菌SMIC： 经MTT法检测，黄芩水煎液对铜绿假单胞菌SMIC为31.25mg/ml。倒置显微镜下观察结果见图1。

图1 倒置显微镜下观察铜绿假单胞菌的生物膜情况（×4000）

a.对照孔，b.铜绿假单胞菌培养24h（未形成生物膜），c. 铜绿假单胞菌培养48h（形成生物膜），d.药物浓度31.25 mg/ml作用后铜绿假单胞菌的生物膜，e. 药物浓度125mg/ml作用后铜绿假单胞菌的生物膜

由上可知，黄芩水煎液药物浓度在3.93mg/ml以下时对铜绿假单胞菌无显著性抑制作用；药物浓度达到3.93mg/ml或以上时抑制效果较为明显。

5 讨论

为了从中药中发掘具有抗铜绿假单胞菌BF的药物，本实验通过研究清热解毒药中的黄芩在体外对铜绿假单胞菌BF的影响，来寻找抗铜绿假单胞菌BF的更为有效的新药。结果显示，黄芩水煎液对铜绿假单胞菌悬浮菌的最低抑菌浓度（MIC）为1.95mg/ml，对生物膜的SMIC为31.25mg/ml，黄芩水煎液浓度在0.98mg/ml或以上时对硫酸庆大霉素有协同作用。

黄芩水煎液联合硫酸庆大霉素对铜绿假单胞菌作用的结果表明，黄芩水煎液与硫酸庆大霉素联合用药有一定的协同作用，其产生协同作用的机理有待于进一步研究。

本实验结果表明，生物膜是黄芩抗铜绿假单胞菌的作用靶点之一，其是否有其它靶点值得进一步研究。

参考文献

[1] 彭程，肖永红.大环内酯类药物对铜绿假单胞菌生物膜的作用[J]. 中国抗感染化疗杂志，2001，1（1）：7-9.

[2] 杜虎 ，陈在贤.氟喹诺酮类药物对铜绿假单胞菌生物膜的清除效应[J]. 重庆医学，2005，34（4）：592-594.

[3] National Committee for Clinical Laboratory Standards， 1997. Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts： approved standard. NCCLS document M27- A. National Committee for Clinical Laboratory Standards， Wayne， Pa.