大庆地区马齿苋总黄酮含量测定方法探讨

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[摘要] 目的 为大庆地区马齿苋的内在质量分析提供依据。 方法 马齿苋先用石油醚除去亲脂性杂质，再用甲醇超声提取得到总黄酮；以槲皮素为对照，采用AlCl3显色法测定总黄酮含量。 结果 槲皮素在0.0624～0.9984 μg/mL范围内线性关系良好，回归方程Y = 1.4224X-0.0234（r = 0.9991）。 结论 该方法简单、准确、重复性好，可用于大庆地区马齿苋的总黄酮含量测定。

[关键词] 马齿苋；总黄酮；紫外分光光度法；AlCl3显色法

[中图分类号] R284.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）01（b）-0108-03

Explore of the determination of the content of total flavonoids from Portulaca oleaacea L. in Daqing

HAN Chenghua BAI Yuhua YU Chunyue GAO Sainan YANG Luming

Harbin Medical University in Daqing， Heilongjiang Province， Daqing 163319， China

[Abstract] Objective To provide the basis for internal quality analysis of Portulaca oleaacea L. in Daqing. Methods Portulaca oleaacea L.was degreased with ligarine， extracted total flavonoids with methanol by the ultrasonic extraction method. The content of total flavonids was determined by AlCl3 colorimetry by comparing with quercetin. Results Comparion showed a good linear relationship at the range of 0.0624-0.9984 μg/mL， regression equation was Y = 1.4224X-0.0234 （r = 0.9991）. Conclusion The method is simple， accurate and repetitious， which can be used in determination of the content of total flavonoids fom Portulaca oleaacea L. in Daqing.

[Key words] Portulaca oleaacea L.； Total flavonoids； UV spectrophotometry method； AlCl3 colorimetry

中药马齿苋为马齿苋科植物马齿苋Portulaca oleracea L.的干燥地上部分，具有清热解毒、凉血止血、止痢等功效，主要用于治疗热毒血痢、痈肿疔疮、湿疹、丹毒、蛇虫咬伤、便血、痔血、崩漏下血等[1]。现代药理研究表明，马齿苋具有抗肿瘤、缓解糖尿病的症状及抗菌消炎、抗氧化、降血脂等药理作用[2-5]。马齿苋首载于《神农本草经》，是我国原卫生部划定的78种药食同源的野生植物之一，既可入药，又可食用，为《中国药典》2010年版所收载。马齿苋生活力极强，耐寒、耐涝、耐荫、耐瘠薄，对土壤要求不严、且河北省农科院在盐碱地试种的新品种特选1号马齿苋，表现出产量高，尤其耐盐性强、抗病性好等特征[6]，而大庆地区历史上是低洼湖区沉积而成，土壤盐碱度较高，有良好的种植前景。

目前药典上马齿苋除性状鉴别、理化鉴别外，尚无专属性较强的化学对照品作为定量指标控制其药材质量。有关马齿苋中总黄酮含量测定，国内外采用的方法一般是以芦丁为对照的经典NaNO2-Al（NO3）3-NaOH比色法[7-10]。已有文献报道此方法测定总黄酮专属性差[11]，又有文献报道马齿苋中主要含有游离黄酮化合物[12]，说明此方法并不适用于所有中草药的总黄酮的含量测定。本实验为寻找更理想的测定大庆地区马齿苋总黄酮含量的方法，对黄酮类化合物的含量测定方法进一步研究，选出最佳的含量测定方法。为完善大庆地区马齿苋的质量分析和开发利用提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

756MC型紫外-可见分光光度计（上海棱光技术有限公司）；UV-7504PC紫外-可见光分光光度计（上海欣茂仪器有限公司）；KH3200DE型数控超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）；ESJ200-4电子天平（沈阳龙腾电子有限公司）。

1.2 试药

芦丁、槲皮素、山奈酚对照品（北京世纪奥科生物技术有限公司）；马齿苋（采摘自大庆市萨尔图区）；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 测定方法的选择

2.1.1 样品和对照品溶液的制备 称取大庆地区马齿苋粉末1.0008 g，加石油醚约140 mL，用索氏提取器提取2 h至无色。药渣转移到锥形瓶中，加入甲醇30 mL，超声提取两次（功率70 W，频率20 kHz，温度60℃），每次40 min，过滤，滤液置于100 mL量瓶中，加甲醇至刻度，再取1 mL到50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，即为样品溶液。精密称取芦丁，槲皮素及山奈酚标准品，分别加甲醇制成0.05 mg/mL的溶液，即得对照品溶液。

2.1.2 直接扫描法 取适量的样品溶液及芦丁、槲皮素、山奈酚对照品溶液，用甲醇空白作参比，依次于200～600 nm范围扫描。直接扫描法的结果表明芦丁对照品溶液的最大吸收波长：260 nm和360 nm；槲皮素对照品溶液的最大吸收波长：270 nm；山奈酚对照品溶液的最大吸收波长：325 nm；样品溶液的最大吸收波长：340 nm和420 nm。以上四种溶液的最大吸收波长各不相同。

2.1.3 AlCl3显色法[13] 取芦丁、槲皮素、山奈酚对照品溶液和样品溶液各2 mL，依次置于25 mL量瓶中，各加入1%的AlCl3溶液4 mL，再加H2O至刻度，混匀，静置10 min，用试剂空白作参比，依次于200～600 nm范围扫描[14-15]。芦丁对照品溶液的最大吸收波长：360 nm；槲皮素对照品溶液的最大吸收波长：420 nm；山奈酚对照品溶液的最大吸收波长：420 nm；样品溶液的最大吸收波长：340 nm和420 nm。AlCl3显色法的结果可看出在420 nm处，样品（图1）、槲皮素对照品（图2）、山奈酚对照品（图3）溶液均有最大吸收。

图1 样品的AlCl3显色法扫描图

图2 槲皮素的AlCl3显色法扫描图

图3 山奈酚的AlCl3显色法扫描图

2.1.4 NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法 分别吸取样品溶液和芦丁对照品溶液3 mL，各转移至25 mL量瓶中，分别加水到6 mL，加5%NaNO2溶液1 mL，摇匀，静置6 min，加10%Al（NO3）3溶液1 mL，使混匀，静置6 min，加10%NaOH溶液10 mL，用水稀释至刻度，混匀，静置15 min，用试剂空白作参比，于200～600 nm范围扫描。NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法的结果显示芦丁对照品溶液的最大吸收波长和样品溶液的最大吸收波长不在510 nm。所以用芦丁作对照品测大庆地区马齿苋中黄酮类化合物误差大，结果不准确。

通过对上述三种方法的比较，本实验选择了操作简单的AlCl3显色法，对照品选择了价廉、对应性好的槲皮素，并以槲皮素作为对照，对AlCl3显色法进行了方法学考察。

2.2 AlCl3显色法的线性关系考察

2.2.1 绘制标准曲线 将槲皮素配成6.24 μg/mL的对照品溶液，分别取0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL依次置于25 mL量瓶中，各加1%AlCl3溶液4 mL，分别加水至刻度，混匀，静置10 min，用试剂空白作参比，在420 nm处测吸光度。以样品的浓度（μg/mL）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，绘制标准曲线，Y = 1.4224X-0.0234，r = 0.9991，在0.0624～0.9984 μg/mL范围内线性关系良好（图4）。

图4 槲皮素标准曲线

2.2.2 精密度测试 取样品溶液适量，在420 nm处连续测定样品溶液的吸光度5次，计算RSD = 0.1%，表明仪器的精密度良好。

2.2.3 稳定性测试 取适量的样品溶液，在0、30、90、150、210、300 min的时间间隔内依次测定样品溶液的吸光度，计算RSD分别为0.1%、10.6%、13.0%、16.8%、19.0%，表明样品溶液在30 min内较稳定，可靠。

2.2.4 重复性测试 准确称定大庆地区马齿苋样品粉末5份，按“2.1.1”项下平行制备样品溶液。测得样品溶液中总黄酮的平均含量为0.14%，RSD=2.99%，说明重复性良好。

2.2.5 加样回收率实验 取已知含量的大庆地区马齿苋样品粉末5份，按“2.1.1”项下平行制备样品溶液，依次准确加入适量的槲皮素对照品，结果见表1。由结果可知，该方法准确、可行。

表1 加样回收率实验结果

3 讨论

本实验中采用直接扫描法对马齿苋样品溶液、芦丁、槲皮素、山奈酚对照品在200～600 nm范围直接扫描的结果，四种溶液的最大吸收波长各不相同；采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法测定马齿苋样品和芦丁对照品溶液的最大吸收波长不一致。如果采用上述两种方法测定大庆马齿苋总黄酮的含量，显然结果不准确。而采用AlCl3显色法测定芦丁、槲皮素、山奈酚对照品溶液和样品溶液的最大吸收波长的结果，槲皮素、山奈酚对照品溶液和马齿苋样品溶液均在420 nm处有最大吸收，且对照品槲皮素价廉易得，并以槲皮素作为对照的AlCl3显色法方法学进行考察的结果显示，以槲皮素作为对照的AlCl3显色法可行。此结果与有的文献指出的马齿苋中主要含游离黄酮类化合物[12]的研究结果相一致，且AlCl3显色法又能在420 nm条件下排除非黄酮类成分的干扰[14]。因此，对马齿苋或大庆地区马齿苋用比色法进行总黄酮含量测定时，建议用以槲皮素为对照的AlCl3显色法。此方法节省试剂，操作简单，灵敏度高，重复性和稳定性良好，可以成为大庆地区马齿苋总黄酮含量测定的理想的方法。

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（收稿日期：2013-11-11 本文编辑：卫 轲）