比浊法测定硫酸抗敌素效价
开篇：润墨网以专业的文秘视角，为您筛选了一篇比浊法测定硫酸抗敌素效价范文，如需获取更多写作素材，在线客服老师一对一协助。欢迎您的阅读与分享！
摘 要 目的：建立比浊法测定硫酸抗敌素效价的方法。 方法：确定比浊法测定硫酸抗敌素的线性范围，在线性范围内选择高、低剂量对硫酸抗敌素进行效价测定，并与管碟法效价测定结果进行比较。结果与结论：比浊法与管碟法测定结果无明显差异，比浊法测定硫酸抗敌素效价具有精确、便捷等特点，可用于产品质量控制。
关键词 效价 比浊法 管碟法 硫酸抗敌素
中图分类号：R917 文献标识码：B 文章编号：1006-1533(2008)11-0519-03
Turbidimetric method in the determination of titer of colistin sulfate
Bian Jinni, Cao Qiong, Li Ping
(Shanghai Xinxianfeng Pharmaceutical Co, Shanghai,201203)
ABSTRACT Objective:
To establish turbidimetric method to determine the titer of colistin sulfate. Methods: The linear range of colistin sulfate by turbidimetric method was measured and the titer of colistin sulfate at high and low dose in the linear range was tested andthe testing results were compared with those of diffusion method. Results and Conclusion: There was no significant difference between turbidimetric and diffusion method. Turbidimetric method can be used for quality control for its accuracy and convenience.
KEY WORDS turbidimetric method; diffusion method; colistin sulfate
国际上一般采用比浊法和管碟法并行的方法来进行微生物效价测定。两者都是通过比较标准品与供试品的抑菌能力来测定药物的抗菌能力。比浊法是《中华人民共和国药典(2005年版)》的新增项目。与管碟法相比较，虽然比浊法在检验品种上受到一定的限制，但其具有较高精确性和重现性，并且操作简便，可明显缩短实验时间。尤其对中间产品的检验具有重要意义。本文建立了比浊法测定硫酸抗敌素效价的方法，并与管碟法进行比较。
1 材料与方法
1.1 仪器
722光栅分光光度计（上海第三分析仪器厂）；CP225D电子天平（Sartoris公司）；HHS-21-6恒温水浴锅（上海豫康科教仪器设备有限公司），HHBII-600恒温培养箱（上海跃进医疗器械厂）。
1.2 培养基与试剂
抗生素检定培养基III（北京三药科技开发公司，批号：070122）；磷酸氢二钾（广东光华化学厂，批号：20050321）；磷酸二氢钾（广东光华化学厂，批号：20031007）；营养琼脂斜面培养基（北京三药科技开发公司，批号：070409）；12%甲醛（上海凌峰化学试剂有限公司 ，批号：071030）。
1.3 菌株
大肠杆菌(E. coli 44103)（中国药品生物制品检定所）。
1.4 标准品与对照品
硫酸抗敌素标准品（中国药品生物制品检定所，批号：130327-200305，效价：22 106 u/mL）；硫酸抗敌素原料药
（上海新先锋药业有限公司，批号：2004-06-06，效价：19 783 u/mL；上海新先锋药业有限公司，批号：2004-06-07，效价：20 356 u/mL）；
注射用硫酸抗敌素（上海新先锋药业有限公司，批号：060505，效价：19 877 u/mL；上海新先锋药业有限公司，批号：060506，效价：19 482 u/mL）。
2 方法
2.1 检定培养基的制备
称取抗生素检定培养基III 19 g，加入1 000 mL水，加热煮沸至完全溶解，过滤，调节pH至7.0～7.2，115℃灭菌30 min后备用。
2.2 pH 6.0磷酸缓冲液的制备
称取2.6 g磷酸氢二钾与8 g磷酸二氢钾，加入1 000 mL水，溶解后115℃灭菌30 min后备用。
2.3 含菌培养基的制备
取大肠杆菌培养物，接种于营养琼脂斜面培养基上，置于36℃恒温培养箱中培养24 h后，用10 mL灭菌水洗下菌苔，置于试管中，加入适量灭菌水稀释，使其在650 nm波长处的吸光度为1.0［1］。取0.7 mL菌悬液加入100 mL抗生素培养基III中，充分混匀后备用［2］。
2.4 比浊法线性范围的测定
根据标准［3］设计线性实验，以20 u/mL作为中心浓度，剂间比为1.25，线性实验剂量依次为：12.8 u/mL、16 u/mL、20 u/mL、25 u/mL、31.3 u/mL。
称取适量硫酸抗敌素标准品，用pH 6.0磷酸缓冲液溶解并稀释至1 000 u/mL［4］，分别取适量该标准品溶液，用pH 6.0磷酸缓冲液稀释至12.8 u/mL、16 u/mL、20 u/mL、25 u/mL、31.3 u/mL。分别取上述标准品溶液1 mL置于灭菌后的试管中（每个浓度5管），于每管中加入9 mL含0.7 %菌悬液的培养基，立即摇匀，放入36℃恒温水浴中培养4 h［1,6］。另取一支试管加入10 mL含0.7 %菌悬液的培养基与0.5 mL的12 %甲醛，放入冰箱，作为空白对照。将试管取出后，立即放入冰水浴中，加入0.5 mL的12%甲醛［5］，于530 nm波长处测量其吸光度。
2.5 效价测定
根据线性范围实验结果设计实验。低剂量为13 u/mL，高剂量为26 u/mL，剂间比为2∶1。
分别称取适量硫酸抗敌素标准品与供试品，用pH 6.0磷酸缓冲液溶解并稀释至1 000 u/mL［4］，分别取适量该标准品溶液与供试品溶液，用pH 6.0磷酸缓冲液稀释至13 u/mL、26 u/mL。分别量取上述标准品溶液1 mL置于试管中（每个浓度5管），于每管中加入9 mL培养基菌液，立即摇匀，放入36℃恒温水浴中培养4 h［3］。另取一支试管加入10 mL含0.7 %菌液的培养基与0.5 mL的12 %甲醛，放入冰箱，作为空白对照。将试管取出后，立即放入冰水浴中，加入0.5 mL的12 %甲醛，于530 nm波长处测量其吸光度，根据《中华人民共和国药典(2005年版)》方法计算结果。
3 结果
3.1比浊法线性范围
根据2.4项中方法确定比浊法的线性范围，以剂量浓度的对数值为横坐标，吸光度为纵坐标，如图1所示。
剂量浓度的对数值与OD530的线性关系可采用方程：y =0.185x0.680 5，R2 = 0.990 2描述。结果表明，在12.8 u/mL～31.3 u/mL范围内剂量浓度对数值与吸光度线性关系良好，因此可进一步在该范围内选择比浊法效价测定的高、低剂量。
3.2 效价测定
根据2.5项中方法对硫酸抗敌素的效价进行测定，比浊法效价测定结果与管碟法效价测定结果进行比较，结果如表1。
2批数据结果相似，因此采用1批数据作为结果统计。 由以上结果可以得出：管碟法与比浊法效价测定结果并无较大差异，比浊法可信限优于管碟法。
3.3 重现性测定和回收率实验
通过计算每批样品效价测定结果的相对标准偏差RSD，对比浊法与管碟法的重现性进行分析。表2所示的RSD分析表明，比浊法重现性较好。
为了进一步比较比浊法和管碟法的测定效果，对两种方法的回收率进行比较(见表3)。结果表明比浊法具有较好的回收率。
4 讨论
4.1 高、低剂量的确定
在实验过程中发现，通常高剂量的吸光值测定结果比低剂量的吸光值测定结果稳定。这是由于实验中药品浓度较低，从而使稀释过程中的误差对实验结果造成了一定的影响。药品浓度越低，误差对实验结果影响越大。因此在选择高、低剂量浓度时，应尽量在线性范围内选择较高浓度进行效价测定。本实验中选择低剂量为13 u/mL、高剂量为26 u/mL，剂间距为2∶1，符合《中华人民共和国药典(2005年版)》规定。
4.2 比浊法与管碟法对比
从表1的实验结果可以看出，比浊法与管碟法的测定结果并无明显差异。但比浊法可信限明显优于管碟法。在实验过程中发现，管碟法有时会出现抑菌圈边缘不清晰、测量结果不稳定等情况。在比浊法法实验过程中，琼脂中含有的杂质往往影响了药品扩散速度从而导致实验结果不稳定，同时手工滴加药品也会使抑菌圈测量结果产生一定的误差。而比浊法采用仪器测定，具有较高的精密度和灵敏度，因此其实验结果则相对较稳定。同时，RSD与回收率的分析结果也表明了比浊法具有较高的准确性与重现性。
4.3 影响比浊法实验准确性的因素
在比浊法效价测定实验过程中必须注意以下细节，以保证实验准确性：实验用菌液必须在实验当天制备完成，在培养前应摇匀试管，使菌液与药品均匀分布于试管中，以免造成实验数据混乱；实验中所用的培养基必须色泽澄清，培养基中含有的杂质会影响实验的准确性，因此培养基必须经过滤、灭菌后方可使用；在培养结束后，应立即将试管放入冰水浴中，使试验菌同时停止生长，然后再加入12 %甲醛溶液，以避免由于试验菌停止生长不同步而产生的误差；实验中应选择大小、厚度均一的试管，使各个试管中的培养物均衡受热，减小实验误差。
参考文献
1 范兵，刘耀，赵萍. 比浊法测定硫酸卡那霉素注射液的效价［J］.华西药学杂志，2005，20(2)：151.
2 赵晓冬，张亚杰，傅蓉，等. 微生物比浊法与管碟法测定磷霉素钠效价的评价［J］. 实用物与临床，2006，9(2)：75.
3 国家药典委员会编.中华人民共和国药典二部［M］.2005年版.北京：化学工业出版社，2005：附录81-83.
4 文晓玲，刘兴兰，任玺如. 比浊法测定阿奇霉素效价［J］. 中国药事，2005，19(6)：349.
5 李哲媛，康勇，范兵. 微生物比浊法测定硫酸庆大霉素注射液的效价［J］. 药物鉴定，2005，14(3)：38 .
6 霍启录，侯连兵，邵红霞. 微生物比浊法与管碟法测定硫酸庆大霉素效价的评价［J］. 中国药房，2000，11(1)：37.
(收稿日期：2008-02-21)