RNAi的研究进展

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[摘要]rnai是由双链RNA导入而引起的基因沉默现象，是近几年迅速发展起来的一种基因阻断技术。dsRNA经酶切成为siRNA（short interfering RNA），进一步形成RISC（RNA induced silencing complex），在siRNAs引导下切割靶mRNA。RNAi技术在基因研究，疾病的基因治疗等方面均有广阔前景。

[关键词]RNAi；dsRNA；siRNA

[中图分类号]R394[文献标识码]A[文章编号]1673-7210（2007）10（b）-007-03

RNAi（RNA interfering，也称RNA干扰）是利用小双链RNA特异阻断特定基因的表达，并促使靶mRNA降解，从而使细胞表现出某种特定基因缺失表型的现象。由于RNAi对基因表达的阻断具有高效、特异性，已迅速发展成为代替基因敲除的遗传工具。

1 RNAi的分子作用机制

经过众多学者的研究，现已基本阐明了RNAi的作用机制。在不同生物中RNAi的作用机制各有不同,主要分为两种：大于30 nt（核苷酸，nucleotide,nt）的长双链RNA的非特异效应和21～23 nt的短双链RNA的特异效应[1]。RNAi的特异效应作用机制是在转录水平、转录后水平、翻译水平等多个不同的水平上实现的。其中以siRNA转录后水平的RNAi研究最为深入，应用最为广泛，下文将做主要介绍(图1)。

1.1 转录后水平的RNAi机制

转录后水平的RNAi机制是在对线虫、果蝇等生物体进行研究而进一步推导得出来的。不同研究领域的学者相继提出了多种RNAi机制的模型，这些模型大致都将RNAi分为两个阶段：起始阶段和效应阶段。

起始阶段包括：①dsRNA的导入：包括由外源导入或由转基因、转座子、病毒感染等各种方式引入的dsRNA;②dsRNA在细胞内被一种命名为Dicer的酶切割成21~23 nt长的小分子干扰RN断（short interfering RNA, siRNA）。

效应阶段包括：①在siRNA反义链指导下，双链siRNA与一个不同于DICER的RNA酶结合形成沉默复合物RISC。②siRNA双链解旋，正义链被释放出来，RISC被激活。③活化的RISC通过碱基配对识别互补的靶mRNA，siRNA反义链与mRNA复合体中换位，并在距siRNA的3'末端12 nt处切割靶mRNA，从而实现了对mRNA的降解。降解位点多为尿嘧啶。

某些学者认为RNAi过程中还具有自身循环放大机制，并将其归为模型的第三阶段――循环放大阶段，其机制大致如下：

在效应阶段，活化的RISC结合mRNA后，内切核酸酶将mRNA切割成12~23 nt的片段，特异性地抑制了靶基因的表达。同时，释放出来的siRNA可以作为一种特殊引导物，在RNA依赖的RNA聚合物（RdRP）作用下，以靶mRNA为模板合成新的dsRNA，后者又被降解为新的siRNA，进入上述循环，呈放大效应。此过程又称为随机降解性多聚酶链式反应（PCR）[2]。

1.2翻译水平的RNAi机制[1]

翻译水平上的RNAi是抑制相应mRNA的翻译，使相应的蛋白质表达受阻，其中起重要作用的是stRNA (small temporal RNA)，它是由长度约70 nt的RNA形成的茎环样前体，经Dicer酶作用后形成长约21～23 nt的dsRNA， 通过RISC结合在相应mRNA的3'末端非翻译区上,进而阻断mRNA的翻译。

1.3转录水平上的RNAi机制[1]

该机制是通过siRNA与互补的DNA直接发生作用，激发同源DNA甲基化的加强，使目的基因转录受限，表达关闭，进而加强了基因沉默。有报道dsRNA可诱导组蛋白H3及相应DNA区域甲基化。如果甲基化出现在启动子区域,则转录就不能进行,如甲基化出现在编码区,则转录进行,但在转录后水平上沉默。

1.4 非特异效应

许多研究表明，当向哺乳动物转染大于30 nt的长双链RNA（dsRNA）时，由于dsRNA激活双链RNA依赖的蛋白激酶（dsRNA dependent protein kinase, PKR）途径[3]，使EIF-2α因子磷酸化，进而非特异性地抑制翻译，从而使细胞内发生全面的细胞沉默。

1.5 RNAi过程所涉及的主要因子

siRNA：是RNAi作用赖以发生的重要中间效应分子。它是长约21~23 nt的双链RNA小分子，与靶mRNA序列具有同源性。此外，siRNA每条单链 的3'末端均有2~3个非配对的碱基[4]。

Dicer酶：Dicer酶（在果蝇中发现）是一种RNaseⅢ家族中的一种识别dsRNA的酶，据报道其结构含有1个PAZ结构域，1个氨基螺旋酶结构域，2个RNaseⅢ模体及2个dsRNA结构域。在dsRNA导入后，Dicer酶以ATP依赖的、持续方式连续切割dsRNA。在对dsRNA进行切割时，Dicer以二聚体形式参与，每个二聚体包括4个活性中心，在降解RNA时其中的2个要失活,从而使降解过程每隔一定间隔进行,这个间隔正好为22个核苷酸,即每隔22个核苷酸Dicer酶将dsRNA降解一次。而Dicer酶结构上的微小改变将会引起间隔的改变,所以不同的物种产生的siRNA长度也略有不同[1]。

RdRP：许多实验证明，RdRP是RNAi所必需的。RdRP目前仅知其主要是在单链siRNA指导下扩增RNA而加速RNA的过程。由于RdRP的存在，使RNAi能在低浓度下高效快速地进行。

ATP[5]：ATP在siRNA介导中起重要作用，dsRNA被降解为siRNA的过程需要ATP；siRNA解旋，反义链与RISC前体结合形成RISC的过程也依赖ATP。研究还发现，RNAi过程中外源性ATP不能起促进作用。

2 RNAi的特征

高稳定性：以3'末端突出的TT碱基的dsRNA尤为稳定，无需象反义核酸那样进行进行广泛的化学修饰以提高半衰期[6]。

高效率：在低于反义核酸几个数量级的浓度下，就能使目标基因的表达降到极低水平甚至完全抑制，从而产生缺失突变体表型[7]。

高特异性：siRNA除正义链3'末端突出的2个碱基在序列识别中不起主要作用外，其他单个碱基的改变均可能使RNAi效应大大减弱。而针对同源基因共有序列的RNAi则导致同源基因共同失活[5]。

高传递性：RNAi抑制基因表达的效应可以穿过细胞界限，在不同细胞间长距离传递和维持，在某些生物中RNAi还可以传递到后代中去。

3 RNAi应用过程需要解决的几个问题

避免非特异性效应：前述已阐明，在哺乳动物中，当大于30 nt的dsRNA被导入时，可激活PKR途径而导致非特异性抑制。这就要求在设计dsRNA时必须考虑该dsRNA导入时能否避免非特异性效应的出现。多数实验表明，以21~23 nt为最佳选择。

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干涉dsRN段的获取和导入：在实际应用中，siRNA的长度、结构、组成及其触发的效果基因、种属、序列、细胞类型、甚至实验体系的不同而有变异。目前，siRNA的获取大多数仍旧是生化合成，其设计仍处于试验阶段，能否成功地设计出合理实用的siRNA对其能否广泛应用起决定性作用。对RNAi效应的调控：目前对RNAi的研究还限于以双链干涉片段抑制特定基因的表达，对其调控的干涉较少。但大量的研究表明，dsRN段的大小、潜在靶位、活性片段浓度等都是RNAi有效性发挥的影响因素。Yang等还证实RNAi现象可被过剩的不相关的dsRNA竞争性抑制，深入的研究表明，甚至过剩的正义链与反义链也可竞争性抑制RNAi效应。

4 RNAi的应用及前景

4.1遗传学研究的应用

4.1.1 稳定转座子RNAi缺陷可引起内源性转座子的移动。转座子的重要特征之一是具有反向重复序列，生物体通过此序列可以产生dsRNA发夹，启动PTGS效应，所以抑制转座子的移动有利于遗传稳定，防止遗传损害。因此人们认为RNAi的一个自然功能就是转座子沉默[8]。

4.1.2 基因功能分析人类基因组计划中的基因测序已经完成，人类将进入后基因组时代。其主要任务是确定基因的功能，因此迫切需要建立有效、经济的分析基因的技术。

尽管目前对RNAi机制并未完全弄清，但其高效、特异阻断基因的表达已在某些研究中开展。RNAi克服了传统基因功能分析技术要求高，过程繁等缺点，已吸引了越来越多学者的重视。可以预见，RNAi将成为新一代基因组功能研究的有力工具。

4.2 临床应用

4.2.1 抗病毒David等认为在动物中RNAi代表一种古老的抗病毒反应，与植物的PTGS（转录后的基因沉默）一样可抵抗病毒的感染，目前这一观点已被普遍认可。

目前，利用体外培养人类细胞研究抗病毒感染，主要限于单链 RNA病毒，包括人类免疫缺陷病毒、流感病毒、丙型肝炎病毒和脊髓灰质炎病毒等。Novina[9]等用针对CD4的siRNA转染Magi-CCR5细胞，产生了对CD4受体表达特异性抑制达75%，Northern杂交发现CD4分子的mRNA明显降低了8倍，从而阻断了HIV-1病毒细胞。Kapadie等[10]用针对HCV的siRNA与表达HCV的质粒共转染人的肝癌细胞株Huh-7细胞，2 d后，Northern杂交检测显示：HCV的RNA含量下降，证明了HCV特异的siRNA抑制了病毒的复制[9]。

RNAi在针对其他病毒，如呼吸道合胞病毒、SARS病毒、脊髓灰质炎病毒，猪瘟病毒等均显示出抑制病毒复制的作用。最近有文献报道RNAi在研制抗SARS药物中显示出特殊的作用。

从当前的这些研究结果可以看出，siRNA通过序列特异性干扰作用，能封闭病毒基因在体内的复制，RNAi成为控制病毒在细胞内复制的重要工具，为病毒治疗提供了新的思路。

4.2.2 抗肿瘤利用RNAi的高效率和高度特异性，我们可以设计特异siRNA分子，沉默目标基因，而正常基因不受影响。这是用RNAi抗肿瘤的基本思路。从现阶段研究的进展看来，RNAi有望成为新一代研究抗肿瘤的重要工具，发挥重要作用。

肿瘤是多因素、多基因的疾病，单个癌基因的抑制难以达到治疗效果，用基因敲除等方法进行治疗研究就造成了时间和经费的浪费。RNAi技术可同时抑制多个基因，且抑制效果互不干扰，并且RNAi识别可以精确到单个核苷酸，对由野生型突变形成的癌基因，如ras、p53等，能产生准确有效的封闭效果，而野生型不受影响[11]。Wilda等针对bcr/abl基因融合位点设计了一段21 nt长的dsRNA分子，特异性沉默了该融合基因，并使表达该融合基因的细胞凋亡，而对不表达该基因的肿瘤无任何作用。最近，Linsl等把针对bcl2基因的mRNA-cDNA杂交体转染到人前列腺癌lncap细胞中，产生了长时期的阻抑bcl2表达效应，这一效应与体外培养的前列腺癌细胞中的RNAi非常相似。

5 结语

RNAi的发现改变了人们对细胞基因调控的传统思路，提供了特异性阻断基因表达的新工具和评价基因功能的新策略，为人类基因功能研究和疾病基因治疗开辟了一条革命性的新领域。尽管其机制仍未完全弄清，但RNAi技术在病毒、肿瘤等尚未根治的疾病提供了新的治疗方案，并带来根治的希望。目前RNAi在各方面的研究已经日新月异，可以相信，不久的将来，将会出现基于RNAi的基因治疗药物，RNAi技术也将成为未来生命研究的重要工具。

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[11]陈竞． RNAi的研究进展[J]．川北医学院学报，2004，19（3）:198.

(收稿日期:2007-08-23)

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