基于SSR标记的清凉峰地区三叶海棠遗传多样性研究
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摘 要： 【目的】评价清凉峰地区三叶海棠的遗传多样性水平，为其保护提供理论依据。【方法】利用10对SSR引物，对清凉峰地区的36份三叶海棠样品进行了遗传多样性分析，并从中随机抽取6，9，12，15，18，27，34株大小不同的样本，组成7个群体进行遗传多样性特征比较。【结果】（1）10对引物在36份样品中的多态性等位基因数（Na）平均值为7.1（5.0～10.0），有效等位基因数（Ne）平均值为3.954（1.527～5.786），平均观察杂合度（Ho）为0.781（0.194～1.000），平均期望杂合度（He）为0.699（0.345～0.827），香农多样性指数（I）平均值为1.458（0.662～1.918）；（2）采用UPGMA法构建的系统树中，很明显地将36份供试样品划分为两组，与用贝叶斯聚类方法得到的结果一致，对三叶海棠所有样品进行的主成分分析进一步证实了以上结果；（3）群体样本量≥15株时，样本量就不会对群体内遗传多样性水平、遗传一致度及群体内等位基因数目产生明显的影响。【结论】清凉峰地区三叶海棠的遗传多样性水平较高，其群体明显分化为2个基因源，三叶海棠群体遗传多样性研究和种质收集保存中的适宜样本量为≥15株，研究供试样品可以反映清凉峰地区三叶海棠遗传多样性的总体水平。
关键词： 三叶海棠； SSR； 遗传多样性； 适宜样本量
中图分类号：S661.4 文献标志码：A 文章编号：1009-9980？穴2013？雪01-0008-08
三叶海棠[Malus sieboldii（Regel）Rehd.]是蔷薇科（Rosaceae）苹果属（Malus Mill.）的多年生木本植物，是重要的苹果砧木资源[1]。世界地域范围内主要分布在中国、日本和朝鲜等地。在中国三叶海棠分布于从南到北的十多个省区[2]。位于浙江临安和安徽绩溪交界处的清凉峰地区，由于国家自然保护区的设立，保存了较完整的三叶海棠的自然居群[3]，但迄今为止还缺乏对其遗传多样性的评价。
随着分子生物学技术的发展，利用分子标记检测植物的遗传多样性水平，在其他苹果属植物如小金海棠[4]、变叶海棠[5]、山荆子[6]、新疆野苹果[7]、观赏海棠[8]等都得到了应用。然而迄今为止，对三叶海棠的研究主要集中在其作为苹果砧木的抗性生理[1]、营养成分和生物学特性[9]等方面。近年来，微卫星荧光标记技术由于其高度智能化的特点，工作效率高，数据准确[10]，已经广泛应用到遗传多样性的研究中[11-12]。为此，研究运用微卫星荧光标记技术，对清凉峰地区的36份三叶海棠样品的遗传多样性进行分析，并从中随机抽取6，9，12，15，18，27，34株不同大小的样本量组成7个群体进行遗传多样性特征的比较，以期从DNA水平上分析该地区三叶海棠的遗传多样性水平，为今后更加合理地收集和保存三叶海棠种质资源提供参考和理论依据。
1 材料和方法
1.1 植物材料
供试的36份样品采自位于浙江省临安市与安徽省绩溪县交界的清凉峰地区的三叶海棠自然居群。于春季采集生长状况良好植株的健康幼嫩叶片，按采集顺序编号，放入装有变色硅胶的自封塑料袋中，迅速干燥，带回实验室，用于DNA提取。为了使采集的样品具有代表性和避免采集植株的遗传一致性，从居群的某一植株开始，散射状采集而且保证采集单株之间的间隔大于20 m。
1.2 方法
1.2.1 DNA提取 采用CTAB法[13]从硅胶干燥的叶片中提取总DNA，稀释到10～30 mg·L-1，储存在-20 ℃备用。
1.2.2 SSR标记 随机抽取8个样品的DNA用62对SSR引物进行扩增，将扩增产物在6%的聚丙烯酰胺凝胶上60 W功率下电泳约2.5 h，电泳后银染显色。Bio-Rad Gel Doc 2000凝胶成像仪（Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA）拍照记录。从62对SSR引物中筛选出17对扩增条带清晰稳定且多态性丰富的引物，因其中部分引物位于相同的连锁群上，遗传距离较近，所以对位于相同连锁群的引物进行筛选，选出位于不同连锁群的10对引物进行SSR扩增。筛选出的10对引物包括从苹果属植物中开发的7对基因组SSR引物： CH02D08、CH01F02、CH03G12、 CH02B10、CH01H01[14]、Hi21e04、Hi02f06[15]，2对EST-SSR引物： MES122、MES17[16]及梨属中开发的基因组SSR引物KA14[17]（表1）。为了实现微卫星多态性的荧光半自动检测，对筛选好的引物进行荧光修饰，在单向引物的5’端加上荧光修饰基团，荧光引物由上海英骏生物技术有限公司合成。
PCR体系总体积为15 μL，其中包括模板DNA 10～20 ng，上、下游引物各0.4 μmol·l-1，dNTP 200 μmol·L-1， MgCl2 2.0 mmol·L-1，0.5 U Taq DNA 聚合酶（TaKaRa）。PCR反应在Eppendorf公司的96孔Mastercycler Gradient PCR仪上进行，其中CH系列引物的反应程序为94 ℃预变性2.5 min，94 ℃变性30 s，65 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min共4个循环，每次循环后退火温度降低1 ℃；然后94 ℃变性30 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共30个循环，最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存[19]。KA系列引物的反应程序为94 ℃预变性2 min，94 ℃变性1 min，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min共10个循环，每次循环后退火温度降低0.5 ℃；然后94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共25个循环，最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存[17]。其余引物的反应程序是94 ℃预变性3 min ，94 ℃变性40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s共35个循环，最后72 ℃延伸6 min，4 ℃保存[16]。对PCR产物用灭菌后的双蒸水稀释，利用MegaBASE 1000测序系统（Amersham Biosciences）检测并测序。
1.3 数据分析
将测序结果导入软件Genetic Profile v 1.0（Molecular Dynamics），参照峰值强度及分子内标的大小，确定微卫星位点扩增片段的区间，对片段大小进行统计，对于出现多峰型的样品，重新进行PCR试验后再确定其片段大小，统计结果保存为Excel格式以备后续分析。
利用遗传数据分析软件GenAlEx 6.3[20]计算多态性等位基因数（Na），SSR位点的有效等位基因数（Ne），观察杂合度（Ho），期望杂合度（He），固定指数（F）及香农多样性指数（I）等遗传多样性指标。
使用NTSYS pc 2.10e软件计算样品的Jaccard遗传相似系数矩阵，按UPGMA法建立36个供试样品的亲缘关系树状图；并基于样品间欧氏距离对36个样品进行主成分分析（PCA）并进行二维作图[21]。
使用STRUCTURE version 2.3.3进行贝叶斯聚类[22]，分析群体的遗传结构并确定最佳的群体分组。首先设定K=1～5，设定Burn-in周期为100 000，MCMC的重复次数为100 000次，采用混合模型和相关等位基因频率，对不同的K值进行10次重复运行，然后将后缀为“_f”的结果文件压缩，上传到“STRUCTURE HARVESTER”网站（http：//taylor0.biology.ucla.edu/ struct_harvest/），通过deltaK确定最佳K值[23]。
利用POPGENE version 1.31软件进行三叶海棠不同大小群体量之间遗传多样性比较、稀有等位基因数目的计算以及聚类分析[24]。
2 结果与分析
2.1 群体内遗传多样性及遗传结构分析
2.1.1 ssr扩增产物的多态性 10对引物在36份样品中的多态性等位基因数（Na）从5（CH02B10和KA14）到10（CH01F02），平均等位基因数为7.1（表2）。每份样品每对引物产生2个相同（单峰）或不同（双峰）的等位基因。有效等位基因数（Ne）从1.527（CH02B10）到5.786（CH01F02），平均值为3.954。本研究中观察杂合度（Ho）为0.194～1.000，平均值为0.781。期望杂合度（He）为0.345～0.827，平均期望杂合度为0.699。Shannon香农多样性指数（I）为0.662 ～1.918，平均值为1.458。而固定指数（F）只有在CH01F02、CH02B10以及MES17中为正值，其余均为负值，说明三叶海棠群体内含有较多的杂合子。
2.1.2 聚类分析 基于SSR数据对36份供试样品进行聚类分析，构建亲缘关系树状图（图1）。从树状图的分析可以得出： 在阈值0.60处，36份三叶海棠样品被分成2组，其中A组包含20份样品，而B组有16份样品。在阈值0.79处，A组又被分成3个亚组，样品1、13、14、32、33和35，样品2、10、15、16、18、19、20、22、25、26、28、31和36分别聚成1个亚组，而样品21与A组的其他样品表现出较大的遗传距离，独立成为1个亚组。B组包括2个亚组，样品3表现特殊，单独成为1个亚组。
各供试样品间的相似系数介于0.514～1.00，其中样品18与26，样品22与36的相似系数最大（1.00），样品5与20，3与19及3与20的相似系数最小（0.514）（数据未列出）。
2.1.3 群体遗传结构分析 将36个样品的K值设为1～5，进行贝叶斯遗传分析，运行5次重复后，发现最适K值为2（图2）。
使用STRUCTURE软件得到了与UPGMA聚类分析相似的结果，根据似然值的对数函数确定最佳类群数为K=2，当K>2时，同一K值不同运行重复间波动幅度非常大。
在K=2的情况下，将36份供试样品分为2组，以绿色为主的20份供试样品视为A组，以红色为主的16份供试样品视为B组。其中部分样品表现为2个基因池的混合，样品21、32、1、35、33以绿色为主体，构成A组中的1个亚组；样品8、17和6以红色为主体，构成B组的第1亚组，由于样品27中红绿的比例与其他的差别较大，可以认为是在B组中独立成为第2亚组（图3）。
对三叶海棠所有样品进行的主成分分析，进一步证实了以上的结果，PCA结果（图4）显示，36个样品被明显分成2组，表明三叶海棠之间产生了一定的遗传分化。在右侧的一组中可以分成2个亚组，其中样品21与其他样品之间有一定的界限。左侧的一组样品中，样品27也表现出与其他样品之间存在一定的差异。
2.2 不同大小样本量群体的遗传多样性分析
2.2.1 不同大小样本量群体的遗传多样性参数比较
因供试的36株三叶海棠单株的聚类分析中，18与26及22与36的遗传相似系数分别为1，所以在下面的研究中去掉了18及22号样本，从剩余的34株单株中，随机抽取6，9，12，15，18，27，34株组成具有不同样本数量的7个群体进行遗传多样性的比较（表3）。随着样本量的增加，平均等位基因数（Na）、有效等位基因数（Ne）、香农多样性指数（I）呈上升的趋势。通过比较可以看出Control（34）与Ⅰ（6）的差别最大，平均等位基因数（Na）分别为7.1和4.1，有效等位基因数（Ne）分别为4.02和3.035，香农多样性指数（I）分别为1.472和1.169，表明样本量的大小影响了群体的遗传多样性的分析结果。但是在样本量大于15株以后，Ne与对照组Control（34）的差异不显著。各群体的观察杂合度（Ho）随着样本量增加有下降的趋势，在样本量大于15株以后Ho表现较小的差异，而期望杂合度（He）在Ⅳ（15）中表现出最大值（0.716）。综合考虑各群体间的遗传多样性参数，只要保证样本量不小于15株，样本量的大小就不会对群体内遗传多样性水平产生明显的影响。
2.2.2 不同大小样本量群体的遗传一致度分析 从各群体的遗传一致度的程度来看（表4），与Control（34）的遗传一致度最大的是Ⅵ（27），遗传一致度为0.995，最小的是Ⅰ（6），遗传一致度为0.905。随着样本量的增加，遗传一致度逐渐升高表明样本量的大小对遗传一致度有一定的影响。当样本量大于15株以后，与Control（34）遗传一致度的差异就不明显了，所以样本取样量大于等于15株就足以代表整个群体的水平。
2.2.3 稀有等位基因在不同大小样本量群体内的变化分析 稀有等位基因是指群体内其基因频率低于5%的等位基因。群体内的遗传多样性差异很大程度上是由于稀有等位基因结合或综合到基因型背景中。因群体样本量的不同，会造成稀有等位基因数目的增加或缺失，从而造成等位基因数目的变化。由表5可以看出，Ⅰ（6）和Ⅱ（9）的稀有等位基因数明显的低于Control（34），与对照共有的等位基因数随着样本量的增加呈递增的趋势，而其丢失数呈递减的趋势。样本量大于12株以后，稀有等位基因丢失数目的差异很小，样本量大于18株以后，群体本身所有的稀有等位基因数目同与对照组Control（34）共有的稀有等位基因数目相等。表明样本量的大小影响稀有等位基因的数目，样本量的增加可以增加稀有等位基因的数目，从而可以影响等位基因的数目。
3 讨 论
3.1 三叶海棠群体的遗传多样性及遗传结构
本试验结果表明，清凉峰地区三叶海棠的遗传多样性较丰富（He=0.699，I=1.458，Ne=3.954），高于湖北海棠[25] [Malus hupehensis（Pamp.）Rehd.、（He= 0.262 8， I=0.401 5， Ne=1.437 5）]、变叶海棠[5] [Malus toringoides（Rehd.）Hughes.（He=0.438 9，I=0.628 2，Ne =1.81）]。可能的原因之一是三叶海棠相比后两者，无融合生殖能力较弱[26]，通过杂交进而获得了较丰富的遗传变异。与新疆野苹果[27] [Malus sieversii（Ledeb.）Roem（He=0.261 9，I= 0.408 2，Ne=1.425 2）]、山荆子[6] [Malus baccata（Linn.）Borkh.（H=0.3386，I= 0.496 1，Ne=1.602 1）]等自交不亲和的苹果属植物相比较，三叶海棠的遗传多样性也表现出较高的遗传多样性水平。在野外样品调查采集的过程中我们发现，清凉峰地区由于设立自然保护区的缘故，三叶海棠的分布未受到明显的人为破坏，经过长时间的世代更迭积累了丰富的遗传变异，因此表现出较高水平的遗传多样性。
STRUCTURE的分析结果表明，所选36份样品中存在2个基因源，部分样品表现为2个基因源的混合，其中样品27表现的更为独特。对三叶海棠UPGMA聚类分析发现36份样品明显分为2组，在第1组中，样品21与其他样品相似系数较小，独立成为1个亚组，在第2组中，样品3独立成为1个亚组。主成分分析（PCA）同样将36份海棠样品分成2组，样品21、27均表现出与各自所在组群的样品存在一定的差异。由于不同的分析方法所提供的信息量不同导致不同的分析方法产生的结果并不完全一致。基于清凉峰地区三叶海棠表现出遗传结构的混合和2个基因源存在的事实，清凉峰地区的三叶海棠最适合进行就地保护，从而最大程度地保存清凉峰地区三叶海棠的遗传多样性水平。
3.2 三叶海棠群体遗传多样性研究中的适宜样本量
样本量大小是影响种质遗传多样性和群体内遗传结构分析的重要因素。三叶海棠作为异花授粉的植物，从理论上讲如果群体的样本量无限大，那么所有的遗传特点全部呈现出来，但在实际的操作中，由于人力、物力和财力多方面因素的影响，不可能采集无限多的样本量，而样本量过小则无法呈现出研究对象的遗传特性；群体内的遗传结构要得到完全的体现，稀有等位基因的分布与数目变化情况就要和整个群体的保持一致。所以找出一个适宜群体样本量，使得所选择的群体样本量能代表原始群体的遗传多样性水平是至关重要的。徐重益等[28]在对菜薹种质繁殖群体大小的研究发现： 大于30株的群体能代表200株整体群体的遗传多样性；班霆等[29]在对苜蓿遗传多样性的取样数目的研究中表明： 采用40个单株的DNA混合样是较适宜的群体大小。本研究通过随机抽样得到不同大小样本量的7个群体，通过比较各群体的遗传多样性参数、遗传一致度及不同大小样本量群体内稀有等位基因数的变化情况，表明只要保证样本量≥15株，样本量的大小就不会对群体内遗传多样性水平、遗传一致度及群体内等位基因数目产生明显的影响。这与杨军等[30]在对杜梨实生繁殖群体的研究认为杜梨种质保存、更新的适宜群体量为15株以上的研究结果相似。因此，在三叶海棠种质资源的遗传多样性研究中至少采集15株的样本量，就可以代表原始群体的遗传多样性水平。在迁地保护时，也应该至少有15株的保存量才能保证其群体遗传多样性的完整保存。
综上所述，浙江省临安市与安徽省交界的清凉峰地区的三叶海棠具有较高的遗传多样性水平，群体内也存在一定程度的遗传分化。本研究也为三叶海棠遗传多样性的保存提供了理论基础，同时为我国整个三叶海棠的遗传多样性的评价研究提供了借鉴。
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