鲨鱼皮明胶纯化与生物活性探索

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抗氧化肽的分离与纯化

（1）超滤分离：首先使用分子质量截留范围为8000u和3500u的超滤膜对酶解产物进行超滤分离，将其分为3个分子质量范围不同的组分，调整出口压力不超过0.2MPa。分别收集不同分子质量段的分级产物，冻干后采用DPPH自由基清除法测定其抗氧化活性。（2）阳离子交换色谱：将具有最强抗氧化活性的超滤组分用pH4.0、20mmol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液溶解后用于SP-SphadexC-25（Φ1.6cm×20cm）离子交换层析柱。离子交换层析柱先用0.02mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液（pH4.0）进行充分平衡。上样后，再用0.02mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液（pH4.0）进行平衡，洗去未吸附组分并收集，以含0～0.35mol/LNaCl的0.02mol/L，pH4.0乙酸-乙酸钠缓冲液线性梯度洗脱，收集不同的洗脱峰组分。流速为0.5mL/min，10min/每管，225nm检测吸收值。测定各个洗脱组分的DPPH自由基清除活性。（3）凝胶过滤色谱：将具有最强抗氧化活性的组分收集后进行浓缩，离心后取上清液用于凝胶过滤色谱。凝胶色谱柱SephadexG-50（Φ1.6cm×100cm）先用去离子水平衡。上样完后再用去离子水进行洗脱，直至所有肽被洗脱出来。流速为0.5mL/min，30min每管，225nm检测。分别收集洗脱峰，并测定其DPPH自由基清除活性。（4）反相高效液相色谱（RP-HPLC）①分离将最强活性组分收集后采用RP-HPLC进行进一步分离，色谱条件：C18反相色谱柱（4.6mm×250mm），检测波长215nm；流动相：A液，0.1%TFA；B液，0.085%TFA+100%CH3CN，以乙腈体积分数为5%～40%的梯度洗脱，流速1.0mL/min。②鉴定再次使用RP-HPLC对收集到的最强活性组分进行鉴定。色谱条件：C18反相色谱柱（4.6mm×250mm），检测波长215nm；流动相：A液，10mmol/L乙酸铵溶液；B液，10mmol/L乙酸铵+80%CH3CN，以乙腈体积分数为5%～27.5%的梯度洗脱，流速1.0mL/min。

抗氧化活性的测定

ABTS自由基清除活性的测定明胶水解液的ABTS自由基清除活性测定参照ABTS自由基分析法。以去离子水将ABTS溶解，使ABTS浓度达到7mmol/L，加入过硫酸钾，使过硫酸钾的浓度为2.45mmol/L。之后将该溶液在室温下置于暗处过夜12～16h。将生成的ABTS自由基溶液用磷酸缓冲液（PBS，0.2mol/L，pH7.4）稀释，使其在734nm下的吸光值为0.70。取0.1mL酶解液与2.9mLABTS自由基液混合，摇匀30s，暗处反应10min，然后在734nm下测定反应液的吸光值。以蒸馏水代替水解液作空白[20]。清除率（%）=（A0-Aj）/A0×100%式中，A0———2.9mLABTS试剂与0.1mL蒸馏水混合液的吸光值；Aj———2.9mLABTS试剂与0.1mL酶解液混合液的吸光值。抗脂质体过氧化活性的测定用等体积新鲜的鸡蛋卵黄和PBS（pH7.4，0.1mol/L）混合，使用前稀释25倍并用磁力搅拌机搅拌均匀。在试管中分别加入2.4mL卵黄稀释液、2.4mL25mmol/LFeSO4•H2O、200μL水解液样品，混匀后在37℃下水浴4h，加入0.8mL50%三氯乙酸和2mLTBA，混匀后在95℃恒温30min。冷却至室温后，8000r/min离心20min，取上清液于532nm下测定吸光值。以蒸馏水代替水解液作为空白[21]。抑制率（%）=〔（A0-Aj）/A0〕×100%式中，A0———空自对照组的吸光度；Aj———样品组的吸光度。细菌低温保护活性的测定取新鲜制备的大肠杆菌一级菌液100μL，接种于10mLLB培养基中，37℃培养至OD600nm达到0.8后，菌液先用无菌双蒸水稀释10000倍，分别吸取100μL加入900μL无菌水和终质量浓度为250μg/mL的多肽样品中，终体积为1000μL，其中，无菌水为空白对照。在-20℃分别放置0h和24h之后取出100μL菌液，用于计数细菌菌落数，并计算存活率，以此判断多肽样品对大肠杆菌的低温保护活性[22]。

抗氧化肽的分离纯化

凝胶过滤色谱将组分B收集并经浓缩后上到SephadexG-50凝胶过滤层析色谱柱上，测量吸光值。如图4和图5所示，结果得到3个峰，活性鉴定表明B-Ⅲ具有最强的DPPH自由基清除活性。反相高效液相色谱如图6和图7所示，将组分B-Ⅲ用C18反相高效液相色谱进行分离，收集各主要组分并测定其抗氧化活性，结果表明B-Ⅲa、B-Ⅲc及B-Ⅲd这3个组分具有最高的DPPH自由基清除活性。因此，我们收集这3个组分进行鉴定并对其进行其它生物活性的表征。RP-HPLC鉴定多肽在C18上的保留与流动相中离子对试剂的种类及含量密切相关，因此可以通过改变流动相中的离子对试剂来改变样品的保留行为，从而对其纯度进行鉴定。如图8所示，将流动相中的离子对试剂改为乙酸铵后，3种多肽均能被C18高效液相色谱柱吸附。用含10mmol/L乙酸铵的乙腈进行梯度洗脱，色谱图结果显示其均基本为单一的峰，说明它们都已经达到较高纯度。DPPH自由基清除能力测定B-Ⅲa、B-Ⅲc和B-Ⅲd这3种多肽组分对DPPH自由基清除能力的结果，如图9。从图中可知，B-Ⅲa具有最高的清除DPPH自由基的能力，而B-Ⅲc和B-Ⅲd对DPPH自由基的清除能力则基本一致，它们的IC50分别为63.56、98.70以及100.27g/mL。2.3.2ABTS自由基清除能力测定B-Ⅲa、B-Ⅲc和B-Ⅲd3种多肽对ABTS自由基清除能力的结果，如图10所示。从图中可知，B-Ⅲa和B-Ⅲd和清除能力基本一致，并且均显著高于B-Ⅲc的清除能力，它们的IC50分别为82.34、90.97以及84.58g/mL。抗脂质体过氧化活性测定图11为3种多肽抑制Fe2+诱导卵黄脂蛋白多不饱和脂肪酸过氧化反应能力的结果。从图中可知，B-Ⅲa具有最高的抑制活性，其次是B-Ⅲd，而B-Ⅲc的活性最低。B-Ⅲa和B-Ⅲd的IC50分别为183.13和219.52g/mL，而由于B-Ⅲc的抑制率在试验浓度范围内未能超过50%，故无法计算IC50。细菌低温保护活性分别配制质量浓度为250g/mL的B-Ⅲa、B-Ⅲc以及B-Ⅲd溶液，测定细菌低温保护活性，结果见图12和表1。从上图可以看出，加水的阴性对照组的大肠杆菌在经过低温处理之后的存活率为0%，而加了B-Ⅲa、B-Ⅲc和B-Ⅲd的大肠杆菌的存活率分别为42.68%、81.88%和87.50%，这说明B-Ⅲa、B-Ⅲc和B-Ⅲd均具有细菌低温保护活性，并且B-Ⅲc和B-Ⅲd的低温保护活性最强，显著高于B-Ⅲa。3讨论本研究经过超滤、SP-SephadexC-25强阳离子交换色谱、SephadexG-50凝胶过滤色谱和C18高效液相色谱等纯化步骤，从鲨鱼皮明胶酶解产物中分离得到了3个具有抗氧化活性的多肽B-Ⅲa、B-Ⅲc和B-Ⅲd。细菌低温保护试验表明，B-Ⅲa、B-Ⅲc和B-Ⅲd均能显著提高大肠杆菌在-20℃下的存活率。有研究表明，低温冻害对大多数生物体是致死性的，其中很重要的一个原因就是它会导致细胞内环境脱水、结晶，造成细胞物理性的损害或死亡[24]。抗冻蛋白或抗冻多肽因为具有抑制低温条件下冰晶的生长、减少细胞损伤等特点而备受人们关注。

ShaoyunWang等[25]已经在胶原蛋白酶解液中发现抗冻活性多肽，并且表明分子质量范围在700～1400u的阳离子多肽具有较高的抑制冰晶重结晶的活性。因此，本研究的细菌低温保护试验结果与此报道相一致。另一方面，生物体在正常的生命活动中都会产生活性氧。当细菌遭受低温冻害后，其活性氧代谢系统就会发生失调，细胞内活性氧的大量积累而使细胞内活性氧的产生与清除平衡受到破坏，从而使膜脂中不饱和脂肪酸发生过氧化作用，造成膜系统结构和功能的损伤，严重时甚至引起整个细胞膜系统结构的解体。而在加入具有抗氧化活性的多肽后，它就能清除这些活性氧，从而在一定程度上起到了保护菌体的作用。

作者：江勇 汪少芸 赵珺 饶平凡 单位：福州大学生物科学与工程学院