机械化学法提取荷叶总黄酮的工艺研究

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摘要：试验以荷叶总黄酮的提取率为指标，通过单因素和正交试验对机械化学法辅助提取荷叶总黄酮的工艺进行了优化。结果表明，机械化学法辅助提取荷叶总黄酮的最佳工艺条件为：以水为溶剂，以Na2CO3/Na2B4O7（1∶2，m/m）为助剂，助剂用量（占物料干重）为18%，料液比（g/mL）为1∶40，提取时间为25 min，提取温度为80 ℃。该工艺条件下，荷叶总黄酮提取率较乙醇法提高了61.1%。机械化学提取法具有提取率高、时间短、无需有机溶剂、绿色环保等优点，是提取荷叶总黄酮的一种有效方法。

关键词：机械化学法；荷叶；总黄酮；正交试验

中图分类号：TS201.2；R284.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）23-5825-03

《本草纲目》中记载：“荷叶服之，令人瘦劣，单服可以消阳水浮肿之气”。荷叶除了含有普通植物所共有的碳水化合物、脂类、蛋白质、单宁等常规化学成分外，还含有具有明显生物活性和生理功能的黄酮类化合物和生物碱这两大类物质[1，2]。目前，中国对于荷叶黄酮的提取主要采用的是醇提法及热水提取法等传统提取方法，提取率并不高。醇提法提取过程中乙醇挥发性强、易燃、操作过程繁琐、生产成本较高；由于黄酮在水中溶解度较低，水浸法提取效果也不理想。因此，选择合适的增溶剂以提高水提法的效率有着重要的意义。

机械化学法包括机械粉碎和固相化学反应两部分。机械粉碎使植物材料微粉化，增加颗粒比表面积，破碎细胞壁，暴露有效成分，在物料表面形成新鲜切面，固相化学助剂在新鲜切面上与有效物质发生反应，有效成分被修饰，从而改变了有效成分的溶解特性，进而提高了这些成分在特定溶剂中的溶出率[3，4]。本研究采用机械化学法，以荷叶为原料，以水为溶剂，以荷叶中总黄酮的提取率为考察指标，通过单因素试验和正交试验对机械化学法辅助提取荷叶总黄酮的条件进行优化，确定最佳提取工艺条件。以期为荷叶黄酮的开发利用提供一种低廉高效、绿色环保和有效可行的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

荷叶：采自湖北省荆州市西郊荷塘的睡莲叶。芦丁标准品、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、环糊精、碳酸钠、碳酸氢钠、无水硼砂、95%乙醇、无水乙醇等试剂均为分析纯。

电热鼓风干燥箱，上海仪器总厂；高速万能粉碎机，北京市永光明医疗仪器厂；723C型可见分光光度计，上海欣茂科学仪器厂；低速大容量离心机，上海安亭科学仪器厂；标准分样筛，新乡永清筛分机械有限公司；HH-4型数显恒温水浴锅，国华电器有限公司；PL303型电子天平，上海精密科学仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 机械化学法提取荷叶总黄酮的工艺 机械化学法提取荷叶总黄酮的工艺如图1所示。采摘的原料叶置于电热鼓风干燥箱中，在60 ℃恒温干燥并粗粉碎后保存备用。用120目的标准分样筛筛分荷叶粗粉，取筛下的粉末适量并与一定量的研磨助剂混合，投入研磨机中研磨10 min。精确称取研磨后的细粉1.0 g，加入50 mL水，室温搅拌提取10 min，离心，取上清液，沉淀重复提取2次，合并上清液，浓缩，水定容滤液至50 mL，得供试品溶液。

1）助剂的筛选。荷叶中的黄酮类化合物主要是荷叶苷，其次是槲皮素、异槲皮素等常见的黄酮类物质。该类黄酮类物质中含有酚羟基，呈酸性，可被碱中和成盐，在常规操作中常用碱水加热提取[1，2]。另外，由于此类黄酮类物质分子中的邻二酚羟基结构易被碱破坏，与碱作用时需加硼酸保护[3，4]。根据上述性质，本研究选用Na2CO3/Na2B4O7（1∶2，m/m，下同）为助剂共同研磨。

2）单因素试验和正交试验。分别考察助剂用量、料液比、提取时间和提取温度对机械化学法辅助提取荷叶总黄酮提取率的影响。助剂用量（占物料干重，下同）采用5%、10%、15%、20%、25%、30% 6个水平；料液比（g/mL，下同）采用1∶10、1∶30、1∶50、1∶70、1∶90、1∶100 6个水平；提取时间采用10、20、30、40、50、60 min 6个水平；提取温度采用40、50、60、70、80、90、100 ℃ 7个水平。根据单因素试验的结果，进行4因素3水平正交试验（表1），进一步优化机械化学法辅助提取荷叶总黄酮的提取工艺。

1.2.2 与乙醇提取法对比试验 精确称取荷叶细粉1.0 g，加入75%乙醇50 mL，室温[（20±3） ℃]下搅拌提取30 min，测定其总黄酮含量，并与机械化学法的提取结果进行对比。

1.2.3 荷叶总黄酮含量的测定 采用以芦丁为标准品的比色法测定荷叶总黄酮的含量。

1）标准曲线的建立。参照文献[1]的方法建立标准曲线。以黄酮质量x（mg）与吸光度y进行线性回归，得回归方程为：y=0.306x-0.128 3，R2=0.997 8。

2）荷叶总黄酮含量的测定。吸取供试品溶液1.0 mL，置25 mL容量瓶中，加水至6 mL，加5%NaNO2溶液1.0 mL，放置6 min，加10%Al（NO3）3 溶液1.0 mL，放置6 min，加4%NaOH 溶液10 mL，加水定容至刻度，摇匀，放置15 min以上，以上述不含供试品溶液的试液作空白，于500 nm处测定其吸光度。与标准曲线对照得黄酮质量，再除以样品质量即为黄酮的提取率（mg/g）。

2 结果与分析

2.1 机械化学法的单因素试验结果

2.1.1 助剂用量对荷叶总黄酮提取率的影响 助剂用量对荷叶总黄酮提取率的影响结果如图2所示。由图2可知，当助剂Na2CO3/Na2B4O7用量小于20%时，随着助剂用量的增加，荷叶总黄酮提取率也不断增加，助剂用量大于20%以后，荷叶总黄酮的提取率趋于稳定。表明在本试验条件下，添加20%的Na2CO3/Na2B4O7即可使荷叶中的总黄酮物质与碱充分作用。

2.1.2 料液比对荷叶总黄酮提取率的影响 料液比对荷叶总黄酮提取率的影响结果如图3所示。由图3可知，随着溶剂用量的增大，荷叶中总黄酮的提取率逐渐增加，在料液比为1∶50时达到最大，之后随溶剂用量的进一步增加，荷叶总黄酮提取率的变化幅度不大，趋于稳定，故选择料液比1∶50为宜。

2.1.3 提取时间对荷叶总黄酮提取率的影响 提取时间对荷叶总黄酮提取率的影响结果如图4所示。由图4可知，随提取时间的增加，荷叶中总黄酮的提取率有较为明显的增加，在经过30 min的提取后，荷叶中总黄酮的提取率就逐渐趋于稳定。故提取时间选择30 min。

2.1.4 提取温度对荷叶总黄酮提取率的影响 提取温度对荷叶总黄酮提取率的影响结果如图5所示。由图5可知，随提取温度的升高，荷叶总黄酮提取率呈逐渐上升的趋势，在80 ℃时达到最大，之后随提取温度进一步增加提取率呈下降趋势。故提取温度选择80 ℃左右为宜。

2.2 正交试验与验证试验结果

由表2可见，机械化学法辅助提取荷叶总黄酮的最佳工艺组合为A1B3C1D1，即助剂Na2CO3/Na2B4O7用量为18%，提取温度为85 ℃，料液比为1∶40，提取时间为25 min。各因素对总黄酮提取率的影响次序为料液比>提取温度>提取时间>助剂用量。由方差分析结果（表3）可知，料液比对荷叶总黄酮提取率的影响极显著（P

2.3 与乙醇提取法对比试验结果

精确称取荷叶细粉1.0 g，加入50 mL 75%乙醇，室温[（20±3） ℃]下搅拌提取30 min，测定其总黄酮含量，并与机械化学法在最佳工艺组合条件下的提取结果进行对比，结果如表4所示。由表4可知，机械化学法对荷叶总黄酮的提取率较乙醇提取法高61.1%，表明用机械化学法提取荷叶总黄酮是一种高效环保的方法。

3 结论

机械化学法提取荷叶总黄酮的最佳工艺条件为：以Na2CO3/Na2B4O7为助剂，用量为18%，提取时间25 min，提取温度85 ℃，料液比1∶40。采用机械化学法（用水做溶剂）代替乙醇提取法提取荷叶总黄酮，具有既经济又环保的效果。

参考文献：

[1] 蔡为荣.微波提取荷叶黄酮及其清除羟基自由基的研究[J].食品科学，2004，25（9）：112-114.

[2] 黄阿根，周兰香，谢凯舟，等.荷叶黄酮的化学吸光法及高效液相色谱法分析研究[J].扬州大学学报（自然科学版），2000，3（4）：46-51.

[3] 刘 莹. 机械化学辅助提取刺五加有效成分的工艺研究[D].辽宁大连：大连理工大学，2007.

[4] 王 洋.机械化学法在植物有效成分提取中的应用[D].辽宁大连：辽宁师范大学，2008.