不同诱导方法对赤子爱胜蚓中的金属硫蛋白的影响
开篇：润墨网以专业的文秘视角，为您筛选了一篇不同诱导方法对赤子爱胜蚓中的金属硫蛋白的影响范文，如需获取更多写作素材，在线客服老师一对一协助。欢迎您的阅读与分享！
[摘要] 目的：选择适宜的方法诱导赤子爱胜蚓体内产生金属硫蛋白。方法：采用各种诱导因素（包括Zn、饥饿、振荡和光照）诱导蚯蚓产生金属硫蛋白。蚯蚓经诱导后，整体匀浆，再经热沉淀、乙醇沉淀后，得到其粗提物，用分光光度法测定巯基蛋白的含量。结果：各种诱导因素（Zn、饥饿、振荡和光照）诱导蚯蚓产生金属硫蛋白中巯基蛋白的含量分别为0.041, 0.023, 0.038和0.015 U/mg。结论：采用Zn诱导赤子爱胜蚓体内产生金属硫蛋白较好。
[关键词] 蚯蚓；金属硫蛋白；诱导方法
[中图分类号] Q513[文献标识码]A [文章编号]1673-7210（2009）01（c）-020-02
Effect of metallothionein in earthworms with different methods of induction
CHEN Jing
(Bioengineering College, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou310053, China)
[Abstract] Objective: To choose the best induction method of metallothionein in earthworms. Methods: Metallothionein was induced by different methods of induction, such as Zn, hunger, vibration and illumination. The whole earthworm homogenate after induction was followed by heat precipitation and ethanol precipitation. The content of sulfhydryl protein in the crude extraction was determined by spectrophotometer. Results: The contents of sulfhydryl protein of metallothionein, which was induced by different factors(Zn, hunger, vibration and illumination), were 0.041, 0.023, 0.038 and 0.015 U/mg respectively. Conclusion: The inducement with Zn is a better method to induce metallothionein in earthworms.
[Key words] Earthworm; Metallothionein; Induction
金属硫蛋白（metallothioneins，MT）是一类广泛存在于生物界的低分子量、富含半胱氨酸的金属结合蛋白，具有参与机体微量元素储存、运输和代谢、拮抗电离辐射、清除羟基自由基、重金属解毒及参与激素和发育调节、增强机体应激反应等广泛的生物学功能[1]。MT能结合汞、镉、铅等有毒重金属离子，而且结合后就成为稳定的金属硫蛋白的一部分，从而使其失去对细胞的毒害作用，并通过体内运转功能将其转移出体外。目前，经诱导合成的ＭＴ主要有镉金属硫蛋白和锌金属硫蛋白。然而目前金属硫蛋白的研究多以哺乳动物为材料，低等动物研究报道较少，蚯蚓作为低等环节动物，具有抗重金属及富集重金属的特性[2]。有关蚯蚓金属硫蛋白的分离、纯化和特性的研究已有报道[3-5]，但未见赤子爱胜蚓中金属硫蛋白不同诱导方法的研究。本文就MT的诱导方法作一研究，以期有助于选择和建立适宜的诱导方法。
1 材料、仪器与试剂
1.1 仪器与试剂
离心机UNIVERSAL 32（Hettich Gmb＆Co. KG），循环水式多用真空泵SHBⅢA（河南省太康科教器材厂），TU-1900双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司），摇瓶柜HYG（江苏太仓市实验设备厂）。所用试剂均为分析纯。
1.2 材料
赤子爱胜蚓由杭州新绿生态技术有限公司提供，经姚振生教授鉴定为Eisenia foetida sarigny。
1.3 培养基
培养基Ⅰ：干泥和适宜蒸馏水。培养基Ⅱ：干泥、适宜蒸馏水和白菜叶。培养基Ⅲ：干泥、适宜蒸馏水、白菜叶和ZnCl2（每克干泥含500 μg Zn）。
1.4 试剂的配制
考马斯亮蓝染液：考马斯亮兰G-250染液100 mg溶于50 ml 95%乙醇中，加入100 ml 85%磷酸，无离子水定容至1 000 ml，过滤。PBS缓冲液（10×）：NaCl 8 g、KCl 0.2 g、Na2HPO4・12H2O 1.54 g用水定容至100 ml。巯基试剂：DTNB 0.029 7 g、盐酸胍0.008 6 g、EDAT 0.005 6 g用1×PBS定容至50 ml。
2 方法与结果
2.1 金属硫蛋白的诱导
A组：将500g蚯蚓放于培养基Ⅲ中，静置于无光照处培养7 d，温度为18℃。B组：将500 g蚯蚓放于培养基Ⅱ中，在无光照条件下置于摇床中(50 r/min)培养7 d。温度为18℃。C组：将500 g蚯蚓放于培养基Ⅱ中，在有光照条件下培养7 d。温度为18℃。D组：将500 g蚯蚓放于培养基Ⅰ中，静置于无光照处培养7 d。温度为18℃，E组：将500 g蚯蚓放于培养基Ⅱ中, 静置于无光照处培养7 d。温度为18℃，其中E组为对照组。A组采用Zn诱导，B组采用振荡诱导，C组采用光照诱导，D组采用饥饿诱导。
2.2 金属硫蛋白的提取
7 d后将各组蚯蚓洗净后，放在滤纸上，24 h后使之排出污物。加入等体积的Tris-HCl（0.01 mol/L，pH 8.6），4℃匀浆，过夜抽提。10000 r/min离心30 min，取上清。80℃加热5 min，12 000 r/min离心20 min，取上清。加-20℃预冷的乙醇至乙醇浓度85%，-20℃过夜沉淀。10 000 g离心30 min，取沉淀溶于0.02 mol/L Tris-HCl，10 000 r/min离心10 min，取上清，得粗提液。
2.3 总蛋白的检测
考马斯亮兰法测定粗提液中的总蛋白含量：吸取稀释5倍的各样品液100 μl, 加入考马斯亮兰G-250溶液5 ml，混匀, 放置10 min，于595 nm处测定其吸光度。结果见表1。
2.4 巯基蛋白的检测
稀释100倍的粗提液加入等体积巯基试剂，室温静置90 min，420 nm处测定吸光度A值。A值的大小与MT的含量呈正相关[6]。根据巯基蛋白420 nm的吸光度值及总蛋白浓度计算蛋白粗提液中巯基蛋白的相对含量。计算公式为：巯基蛋白相对含量=A420/总蛋白含量。结果见表1。
表1 蛋白含量及巯基含量比较
Table 1 Contents comparison of protein and sulfhydryl
标准曲线计算公式：Y=0.010 9X＋0.035，其中Y为595 nm处的A值，X为100 μl粗提液中含有蛋白的微克数。
3 讨论
3.1 MT含量测定
MT的含量检测方法大多是建立在MT的理化特性和免疫学特性基础上的[7]，这些检测方法主要有四类：①金属亲和检测。主要通过测定MT结合金属的量来计算MT所占的比例。如Hg结合法、Cd血红蛋白饱和法以及Ag饱和法等。②检测巯基含量，以测定巯基来计算MT含量。主要是用经典的生化巯基测定法。③蛋白质的检测。通过MT多克隆和单克隆抗体，利用免疫学方法:如放射免疫分析法（RIA）和酶联免疫吸附分析法（ELISA）。④其他。本文通过测定巯基来计算MT含量，简单方便。
3.2 金属硫蛋白诱导条件的选择
许多金属能诱导MT的合成，例如Cu、Au、Zn、Hg、Cd、Co、Ni和Al等，其他的诱导因素还包括饥饿、光照等[8,9]。本文根据实际条件选择Zn、饥饿、振荡、光照诱导蚯蚓产生MT。由结果可知，其中锌诱导产生的金属硫蛋白含量最高。由文献表明，金属离子是通过增加MT的基因转录而影响MT的合成的，MT基因5'端基因启动区至少存在两个基因调控片段，它们分别与金属和糖皮质激素诱导MT的合成有关。
[参考文献]
[1]邢树礼,王洪光,赵帅.金属硫蛋白的功能及应用前景[J].生物技术通报,2008,2:45-47.
[2]刘学忠,郑志高,王捍东.金属硫蛋白生物学功能研究进展[J].畜牧兽医杂志,2004,23(2):19-21.
[3]马宏宝,佟向军,李令媛,等.镉诱导蚯蚓金属硫蛋白的分离纯化及其溶液构象的研究[J].生物物理学报,1994,10(4):529-536.
[4]李令媛,马宏宝,吕迎春,等.镉诱导威廉环毛蚓（Pheretima guillelmi）金属硫蛋白的分离纯化及特性研究[J].生物化学杂志,1994,10(4):444-450.
[5]佟向军,闵光伟,马宏宝,等.应用扫描隧道显微镜对几种动物金属硫蛋白的比较研究[J].电子显微学报,1995,1(1):21-25.
[6]李建武,肖能庚,作瑞元,等.生物化学实验原理和方法[M].北京:北京大学出版社,1994.224-226.
[7]叶属峰.海洋无脊椎动物金属硫蛋白的分离纯化及检测技术[J].甘肃环境研究与监测,2001,14(1):13-15.
[8]Kille P, Hemmings A, Lunney EA. Memories of metallothionein [J]. Biochimica et Biophysica Acta,1994,12(5):151-161.
[9] Pierre Moffatt, Francine Denizeau. Metallothion in physiological and physiopathological processes [J]. Drug Metabolism Reviews,1997,29(1):261-307.
（收稿日期：2008-10-27）