鸡蛋中粘杆菌素残留含量消除药代动力学研究

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摘要 鸡蛋中粘杆菌素残留含量消除规律研究结果表明，鸡蛋中药物浓度—时间的药动学主要参数为：鸡蛋中药物的达峰浓度（Cmax）为（242.564 1±158.707 4）μg/kg，达峰时间（Tmax）为（10.206 68±0.937 77）d，零阶矩曲线下面积（AUC）（1 668.298±686.869 8）μg/（kg·d），吸收半衰期（K01-HL）（2.459 439±2.255 054）d，消除半衰期（K10-HL）（2.387 610±1.889 865）d，清除率（CL）（0.130 340±0.029 891）L/（kg·d）。

关键词 硫酸多粘菌素E；鸡蛋；药代动力学；高效液相色谱-三重四级杆串联质谱

中图分类号 S859.796 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2013）19-0295-02

Elimination of Colistin Sulfate Residue Content and Its Pharmacokinetics Study in Eggs

ZENG Jian-yong 1 LIU Hong 1 LI Zhen-yuan 2

（1 Zhongshan Quality Supervision & Inspection Institute of Agricultural Products in Guangdong Province，Zhongshan Guangdong 528400；

2 Zhongshan Agricultural Technology Promotion Center）

Abstract Elimination of colistin sulfate residue content and pharmacokinetics study in eggs showed that the main pharmacokinetic parameters of egg were as follow：Cmax was（242.564 1±158.707 4）μg/kg，Tmax was（10.206 68±0.937 77）d，AUC was（1 668.298±686.869 8）μg/（kg·d），K01-HL was（2.459 439±2.255 054）d，K10-HL was（2.387 610±1.889 865）d，CL was（0.130 340±0.029 891）L/（kg·d）.

Key words colistin sulfate E；egg；pharmacokinetics；high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry

多粘菌素是由多粘芽孢杆菌产生的一族理化性质相似、由环状多肽和脂肪酸结合而成的碱性多肽类抗生素，可分为多粘菌素A、多粘菌素B、多粘菌素C、多粘菌素D、多粘菌素E、多粘菌素K、多粘菌素M、多粘菌素P等8种[1]，其中应用最多的是多粘菌素E（又称粘杆菌素，colistin），其对G杆菌有强烈的杀菌作用[2]，同时因具有较好抗菌谱和高效、低毒、残留少的特性而被日本、欧美等国家农业部批准用于饲料添加剂，促进禽畜生长和提高饲料利用率，并且可以防止饲料大规模生产中常出现的由大肠杆菌和沙门氏菌污染引起的疾病[3-4]，我国于1986年批准日本旭化成工业株式会社的产品进口国内市场，反应良好[5]。多粘菌素E是30种以上成分的混合物，粘杆菌素A和粘杆菌素B为主要成分[6]，目前，国内对多粘菌素的研究主要集中在应用以及动物性食品中残留检测方法上，对其毒性及药物代谢方面[7]也有一些初步研究，但比较少。目前国内外对多粘菌素在动物机体内的残留消除规律报道较少，Ziv et al[4]报道了黏菌素在牛体内的药动学和组织残留消除，温 芳等[8]报道了鸡体内硫酸粘杆菌素残留消除规律研究，张纯萍等[7]报道了猪体内硫酸粘杆菌素的药代动力学研究，还没有对鸡蛋中粘杆菌素残留消除规律研究的文献报道。本文尝试研究粘杆菌素在鸡蛋中的药代动力学研究，通过对鸡蛋内药物的吸收代谢过程详尽地认识药物的药理特性，为研究多粘菌素的兽医临床用药以及制定合理的给药方案、休药期提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试鸡只为20只产蛋旺期的母鸡，由中山市御桂堂农业技术有限公司提供。购入后单笼饲养，自由采食和饮水，饲料喂不含黏菌素等抗菌药物的蛋鸡全价饲料。试验前观察3周，临床无异常后进行正式试验。并将正式试验前所采集的不含粘杆菌素药物的鸡蛋作为空白对照。

供试仪器与试剂：高效液相色谱-三重四级杆串联质谱联用仪（Agilent G6410A LC-MSD QQQ）；全自动固相萃取仪（吉尔森公司）；Strata-X固相萃取净化柱（60 mg/3cc，Phenomenex公司）；硫酸粘杆菌素（Colistin sulfate）：含量78.3%，德国Dr.Ehrenstorfera公司；乙腈、甲醇、甲酸（Merck公司），均为色谱纯试剂；试验用水为Watsons蒸馏水；其余试剂均为分析纯。粘杆菌素原料药，含量83.6%，批号为KBT20121011，由湖北康宝泰精细化工有限公司提供。

1.2 试验方法

1.2.1 试剂配制。准确称取原料药24.0 g，用水稀释至10 L，配制成含粘杆菌素2 g/L的饮用水，早晚各配制1次。准确称取0.063 9 g硫酸粘杆菌素标准品，用2 g/L甲酸溶液配制成500 μg/mL的硫酸粘杆菌素标准储备液，置于4 ℃冰箱中避光保存。

1.2.2 动物给药与采样。配制含药浓度2 g/L的饮用水给鸡自由饮用，早晚给药，每天2次，连续给药12 d，其余正常饲喂，从给药第1天开始捡蛋并检测鸡蛋内的药物残留，直至药物残留消除。

1.2.3 样品提取。准确称取5.00 g鸡蛋样品，加入5%高氯酸15 mL，漩涡震荡3 min，摇床振荡20 min，超声提取30 min，4 ℃下10 000 r/min离心10 min，将上清液经润湿的滤纸过滤至离心管中，再加入10 mL乙醚，水平摇床上振荡10 min， 10 000 r/min离心7 min，弃去上层有机层，下层以待净化。

1.2.4 样品净化。全自动固相萃取仪自动过柱，以3 mL甲醇、3 mL水活化Strata-X固相萃取小柱，转移样品提取液至固相萃取柱，接着依次用5%甲醇水溶液3 mL、2%丙酮水溶液3 mL、纯净水3 mL淋洗，最后用0.2%甲酸/甲醇（3∶7，V/V）5 mL洗脱，洗脱液50 ℃下氮气吹至近干。浓缩液用2 g/L甲酸定容至1.0 mL，涡旋混匀，过膜转移至进样瓶，上机检测。

1.2.5 色谱条件。ZORBAX SB-C18色谱柱，2.1 mm×150.0 mm，3.5 μm；流动相：A相为2 g/L甲酸溶液，B相为0.1%甲酸乙腈溶液；梯度洗脱程序：0～5 min，10%～35%B；5～8 min，35% B；8～9 min，90%B；9～10 min，90%B；10.0～10.1 min，B瞬时变化为10%，并保持至16 min。流速：0.3 mL/min；进样量：20 μL。

1.2.6 质谱条件。电喷雾离子源，正离子扫描，多反应监测（multiple reaction monitor，MRM），雾化气压力（ion source gas 1，GS1）为50 psi，毛细管压力（Capillary）为4 000 V，干燥气流速（Gas Flow）10 L/min，干燥气温度（Gas Temp）350 ℃，各物质的质谱检测参数见表1。

1.3 数据处理

计算给药后每个时间点鸡蛋中药物浓度的平均值及标准误差，得到平均药物浓度— 时间数据，采用winnonlin药物动力学参数计算程序，使用微机自动进行处理每只鸡蛋中的药物浓度—时间数据，求出鸡蛋中药代动力学参数。

2 结果与分析

2.1 方法的线性关系、回收率、精密度和检出限

配制一系列标准工作溶液，做基质标准曲线，粘杆菌素以A和B的面积之和进行定量分析，其线性方程、线性范围和相关系数见表2。分别添加高、中、低3个浓度标准溶液，按试验方法进行处理分析，平均添加回收率（每个添加浓度平行测定6次）为70.8%～116.5%，相对标准偏差小于10.4%，结果见表2。检测限按3倍信噪比计算为0.11 μg/kg，定量限按10倍信噪比计算为0.37 μg/kg。

2.2 蛋鸡给药后鸡蛋中粘杆菌素药物浓度的测定

将给药后每日采集的鸡蛋样品按试验的分析方法进行处理、测定，以粘杆菌素A和粘杆菌素B标准曲线回归方程计算鸡蛋中粘杆菌素的浓度，并计算给药后每个时间点鸡蛋中药物浓度的平均值及标准误差，结果见表3。

2.3 药代动力学结果

采用winnonlin药物动力学参数计算程序，使用微机自动进行处理每只鸡蛋中的药物浓度—时间数据，求出鸡蛋中药代动力学参数，结果见表4。

3 结论与讨论

试验着重研究饮水给药试验中硫酸粘杆菌素E在鸡蛋内的残留情况及其消除规律。以2 g/L浓度的饮用水给鸡自由饮用，连续给药12 d，从检测结果分析，多粘菌素E在鸡蛋内K01-HL略大于K10-HL，说明药物的吸收分布比消除稍微缓慢一些，这与粘杆菌素的药物性质有关，临床上动物胃肠给药时粘杆菌素吸收不良，仅能在轻微程度上透过黏膜，即使黏膜表面红肿或烧伤部位局部给药也不吸收，内服后只有小于0.5%的药物被吸收，而且60%～80%从粪便中排出，脏器中分布极少，属于低残留药物[9]。但结果显示，蛋鸡长期连续用药也会引起鸡蛋内药物浓度的蓄积，虽然浓度不是很高，但也不宜长期用药。我国农业部公告第278号明文规定粘杆菌素禁止在产蛋期和产奶期应用，足以证明该药的残留毒性。因此，在研究的饮水给药试验中，用药鸡蛋的弃蛋期也应考虑5 d以上。

4 参考文献

[1] 孙兴权，李哲，林维宣.动物源性食品中多肽类抗生素残留检测技术研究进展[J].中国食品卫生杂志，2008，20（3）：263-266.

[2] 邬行彦，熊宗贵，胡章助.抗生素生产工艺学[M].北京：化学工业出版社，1982.

[3] ZIV G，SCHULTZE W D.Pharmacokinetics of polymyxin Badministered via the bovine mammary gland[J]. J Vet Pharmacol Therap，1982（5）：123-129.

[4] ZIV G NOUWS J F，VAN GINNEKEN C A.The pharmacokinetics and tissue level of polymyxin B，colistin and gentamicin in calves[J].J Vet Pharmacol Ther，1982，5（1）：45-58.

[5] 王丽平，史晓丽，江善祥.硫酸粘杆菌素的毒性研究[J].甘肃农业大学学报，2003，3（38）：340-345.

[6] 苏萌，艾连峰，段文仲，等.高效液相色谱-串联质谱法测定动物源食品中粘杆菌素、多粘菌素B的残留量[J].分析试验室，2012，31（3）：73-77.

[7] 张纯萍，肖希龙，林斌.硫酸多粘菌素E在猪体内的药代动力学和生物利用度研究[J].畜牧兽医学报，2002，33（6）：79-82.

[8] 温芳，肖希龙.鸡组织中硫酸粘杆菌素残留的微生物学检测方法研究[J].中国兽药杂志，2006，40（7）：29-33.

[9] 疏秀林，施庆珊，李诚斌，等.硫酸粘杆菌素药理学研究进展[J].中国兽药杂志，2006，40（10）：31-34.