β?环糊精?苯胺对嘧啶氧杂环丁烷的光敏化裂解

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【摘 要】以1，3-二甲基尿嘧啶和二苯酮反应合成尿嘧啶氧杂环丁烷模型化合物，通过荧光猝灭实验和测定氧杂环丁烷裂解程度的辐照实验研究了其在β-环糊精-苯胺（β-CD-苯胺）存在下的裂解性质，证实了光敏剂通过电子转移裂解氧杂环丁烷的途径，为（6-4）光解酶单电子转移修复机理提供了实验依据。

【关键词】β?环糊精?苯胺；嘧啶氧杂环丁烷；光敏化；电子转移

在UV光照下，生物体的DNA碱基发生光化学反应，生成环丁烷型嘧啶二聚体﹑（6?4）光产物和嘧啶水合物等[1]。过去关于DNA光损伤与修复的研究都集中在环丁烷型嘧啶二聚体上。但最近研究发现，较次要的（6?4）光产物更容易引起基因突变，比环丁烷型嘧啶二聚体更具有变异作用[2]。（6?4）光产物是DNA链中相邻的两个嘧啶碱基在UV光作用下，一个嘧啶分子5，6位上的C=C双键与另一嘧啶分子4位上的C=O或C=N发生Paterno?Buchi反应生成氧杂环丁烷或氮杂环丁烷，此氧杂环丁烷或氮杂环丁烷在-80℃以上不稳定，迅速发生C-O键或C-N键的断裂并伴随着质子转移，异构化生成（6?4）光产物[12]。Clivio等[13]从4-硫胸苷生成（6?4）光产物的过程中分离出了硫杂环丁烷，为（6?4）光产物的生成机理提供了实验证据。

1.DMU和DMT与芳香性羰基化合物的光化学反应

DMU和DMT与二苯酮的光化学反应是由羰基化合物激发引发的，激发三重态的酮以亲电子的O进攻DMU中C=C双键上5位的碳，生成三重态的1，4?双自由基中间体，经系间窜跃到单重态1，4?双自由基后，关环生成氧杂环丁烷，如下。

2.光敏化裂解

荧光淬灭谱图（DMU氧杂环的浓度依次为：β?CD??苯胺水溶液（pH=7.0）荧光淬灭的a=0，b=1，c=2，d=3，e=4，f=5×10-3mol·dm-3）Stern?Volmer曲线（C/10-3mol·dm-3）。

2.1 荧光猝灭实验

荧光猝灭实验在室温下进行，用β?CD??苯胺配制0.1mmol/L的溶液，向光敏剂溶液中加入不同浓度的猝灭剂尿嘧啶氧杂环丁烷（1，2，3，4，5mmol/L），测定最大发射波长处的荧光强度。光敏剂的荧光强度随尿嘧啶氧杂环丁烷浓度的增大而减弱，如图1所示。所得数据代入Stern?Volmer方程，用（F0-F）/F对尿嘧啶氧杂环丁烷的浓度作图，得出Stern?Volmer曲线图2，斜率即为猝灭常数τskq。如果知道光敏剂β?CD??苯胺的荧光寿命（τs），就可以计算出尿嘧啶氧杂环丁烷对光敏剂的荧光猝灭速率常数kq。

2.2 辐照实验

配制氧杂环丁烷和光敏剂的乙腈溶液各2mL（2mM），溶液转移至一支Pyrex管（透过波长大于290nm）或石英玻璃管（透过波长大于250nm）中，高纯氮气鼓饱20min后密封，相同条件下用300W高压汞灯辐照10min，辐照后的溶液用HPLC分析各组分的浓度（分离条件：C?8反相柱，流动相为水：甲醇=40：60，流速1mL/min，柱温30℃）。

利用HPLC分析结果，计算氧杂环丁烷的转化率和裂解产物的产率，结果列于Table4.1。光敏剂β?CD??苯胺对氧杂环丁烷的裂解效率较高，裂解了38%。直接辐照也可以使尿嘧啶氧杂环丁烷裂解，在石英玻璃管中裂解速率比Pyrex管中快很多。裂解产物除了DMU和二苯酮外，还有少量的副产物，这是因为尿嘧啶DMU和二苯酮在辐照条件下不稳定，容易发生二次光解。同时也解释了为什么裂解生成的DMU和二苯酮的产率是不相等的。

光敏剂对氧杂环丁烷的裂解有两种可能的途径：能量转移和电子转移。从能量的角度考虑，氧杂环丁烷在300nm以上的吸收很小，可以估计其激发单重态的能量高于399KJ/mol，光敏剂β?CD??苯胺激发单重态的能量为362KJ/mol，不可能通过能量转移使氧杂环丁烷裂解，只能是还原性的光敏剂与氧杂环丁烷之间发生了电子转移。氧杂环丁烷可看作由两部分构成，尿嘧啶5，6位双键是饱和的，与环丁烷型嘧啶二聚体中的相似，估计其还原电位近似为-2.3V（vs SCE）；而苯的还原电位为-3.2V[3]，氧杂环丁烷的苯基部分被还原是很困难的，因而电子转移的有利部位是嘧啶环部分。由此可以推测氧杂环丁烷裂解的一般反应式为：

激发单重态的光敏剂（1S*）转移一个电子给氧杂环丁烷（Ox）产生光敏剂阳离子自由基（S·+）和氧杂环丁烷阴离子自由基（Ox·-），Ox·-迅速裂解生成DMU和羰基化合物阴离子自由基（CC·-），CC·-再返还电子给光敏剂阳离子自由基。1，3?二甲基胸腺嘧啶氧杂环丁烷阴离子自由基的裂解速率大于5×107s-1[4]。

3.实验

3.1 试剂：尿嘧啶、二苯酮、乙腈、无水乙醇、无水甲醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、石油醚

3.2 仪器：BrukerAv300型核磁共振仪，Lambda Bio20 UV/VIS光谱仪，970CRT荧光光谱仪，HP Agilent 1100高效液相色谱仪。

3.3 合成：①DMU的合成：1g尿嘧啶（8.0mmol）溶于7.5mLNaOH溶液，低温下逐渐加入3mL硫酸二甲酯（31.7mmol），然后将混合物加热至沸腾，冷却后用18mLCHCl3分三次萃取，蒸去溶剂，干燥得0.9g DMU，产率72﹪。将产物在乙醇中重结晶，得白色针状晶体。1HNMR δH：3.1（3H，s，CH3），3.2（3H，s，?CH3），5.6（1H，d，=CH），7.6（1H，d，=CH）υmax（KBr）：3095，1710，1653，683cm-1.m/z：140（C6H8N2O2，计算值：140）。②嘧啶氧杂环尿嘧啶的合成：DMU 1.0g（7mmol），二苯酮2.6g（14mmol），溶于70mL乙腈，溶解后转移至pyrex反应器（透过波长大于290nm），高纯氮气鼓饱下，300W高压汞灯辐照8h，减压蒸去溶剂，得到黄色粘稠液体，加少量二氯甲烷溶解，经硅胶色谱柱分离（洗脱剂为乙酸乙酯/石油醚=1：4），得到白色固体0.34g，产率15﹪。

4.结论

合成了嘧啶氧杂环丁烷模型化合物。通过荧光猝灭实验和辐射实验研究了在光敏剂作用下的裂解性质，证实了单电子转移的裂解机理，并与Falvey等[5]人合成的胸腺嘧啶氧杂环丁烷进行比较，为（6?4）光解酶光复活作用的电子转移机理提供了实验依据。

参考文献：

[1]J.Cadet，P.Vigny，The Photochemitry of Nucleic Acids，in H.Morriso（ed），Bioorganic Photochemitry，Vol.1，Wiley Inerscience，NewYork，1990，pp.1-272.

[2]J.?S.Taylor，Acc.Chem.Res.，1994，27，76-82.

[3]L.Eberson，Springer-Verlag：Berlin，Germany，1987，p32.

[4]A.Joseph，G.Prakash and D.E.FalveyJ.Am.Chem.Soc.，2000，122，11219-11225.

[5]G.Prakash and D.E.Falvey，J.Chem.Soc.，1995，117，11375-11376.

作者简介：高华英（1976—），女，山东临沭人，硕士，讲师，现供职于潍坊工程职业学院，研究方向：有机光化学。