聚丙烯酰胺凝胶中DNA银染色检测方法的改进及其效果比较
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[摘要] 目的：探索快速、经济的银染色方法。方法：本研究对前人文献所报道的一种银染检测方法的检测步骤和试剂用量进行了优化，省略了操作过程中的固定步骤，简化了停显液的组成成分。结果：优化后的方法在配制试剂时只需3种化学试剂，染色液中硝酸银的用量被减少至1.0 g/L，显影液中氢氧化钠的浓度被降低至10 g/L，DNA检测效果表明优化前后的两种检测方法的检测灵敏度均可达5 ng左右。结论：优化后的DNA银染色检测方法更加经济、快速。
[中图分类号] R446.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2011）07（a）-020-03
Optimization of a silver staining method for detecting DNA in polyacrylamide gels and comparison of its effect on test
FAN Jing
College of Chemistry and Life Science, Leshan Normal University, Sichuan Province, Leshan 614004, China
[Abstract] Objective: To establish a cheaper and faster silver staining method. Methods: One silver staining method reported by other researchers had been modified in the steps and reagent dosages, in which, the fixation step had been omitted, the composition of stop solution was simplified. Results: Only three kinds of chemical reagents were required for detecting solutions, the dosage of sivler nitrate in staining solution and sodium hydroxide in developing solution were reduced to 1.0 g/L and 10 g/L respectively. The limit of DNA detection upon visual observation for both of the two methods was approximately 5 ng. Conclusion: The optimized silver staining method is much cheaper and faster.
[Key words] Silver staining; Polyacrylamide gels; DNA
银染检测技术由于操作简单、检测结果易于观察而被广泛应用于分子标记研究的聚丙烯酰胺凝胶内DNA的检测[1-3]。关于DNA银染检测技术的优化在过去已有一些报道[4-9]，为了进一步节省实验操作时间和实验成本，本研究对前人所建立的一种聚丙烯酰胺凝胶中DNA银染检测方法进行了优化，省略了其中的用固定液对凝胶中DNA进行固定的步骤，降低了染色液中硝酸银和显影液中氢氧化钠的浓度，简化了停显液的试剂组成成分，现报道如下：
1 材料与方法
1.1 材料
人体血液由乐山师范学院学生志愿者提供，为防止血液凝固，将1.2 ml血液装入含有0.3 ml浓度为109 mM/L的枸橼酸钠溶液的Eppendorf管中，混匀后放置于-20℃冰箱中保存，PCR扩增引物根据NCBI数据库中人类短串联重复序列微卫星D18S51基因座序列（GenBank登录号：L18333），使用引物设计软件Primer Premier 5设计，上游引物为5'-TGAGGCAGGAGGAGTTCTTG-3'，下游引物为5'-ATGTTGGCTTCTCTCTGTTCT-3'，DNA分子量标记DL2000 购自天根生化科技（北京）有限公司。
1.2 方法
1.2.1 D18S51基因扩增 基因组DNA参照文献用碘化钾方法提取[9]，D18S51基因座的扩增体系为25 μl，各反应成分的终浓度为1.0×PCR buffer，2.0 mmol/L MgCl2，200 μmol/L 每种dNTP，引物浓度为0.4 μmol/L，1 μl基因组DNA（约27 ng），Taq DNA聚合酶1.0 U，PCR扩增条件为：95℃预变性4 min，随后94℃变性50 s，58℃退火35 s，72℃延伸35 s，共30个循环，最后72℃保温10 min。
1.2.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染检测 聚丙烯酰胺凝胶浓度约为7%，厚度为1.0 mm，由14.67 ml蒸馏水、23.33 ml 12%聚丙烯酰胺凝胶母液、2 ml 10×TBE配制而成，电泳缓冲液为0.5×TBE，分别将DNA marker DL2000和D18S51基因座PCR扩增产物上样至聚丙烯酰胺凝胶的点样孔中，电泳时电压为250 V，时间约为2.5 h，电泳结束后，揭开玻璃板的短板，将聚丙烯酰胺凝胶依次放入各种检测溶液中处理，具体参照表1。
2 结果
2.1 显影液中氢氧化钠剂量的优化
在配制检测溶液所需的所有试剂中，氢氧化钠的用量是最大的，为了有效降低实验成本，摸索检测溶液中氢氧化钠的较低用量，本实验选取氢氧化钠作为单因素影响因子，其他试剂的成分和用量同表1中优化后的方法，研究了显影液中添加不同浓度的氢氧化钠对DNA检测效果的影响，结果表明当氢氧化钠的浓度为10、20、30 g/L时，均能得到具有清晰凝胶背景的深黑色DNA条带，当氢氧化钠的浓度为5 g/L时，凝胶背景较浅但DNA条带反差不明显，当氢氧化钠的浓度为1g/L时，凝胶背景较深且DNA条带几乎不能识别（图1），因此一定程度的碱性环境是DNA显带的前提，10 g/L氢氧化钠浓度可以作为较为经济的用量。
每个泳道上样样品为20 ng DNA分子量标记DL2000。泳道1：1 g/L氢氧化钠； 泳道2：5 g/L氢氧化钠；泳道3：10 g/L氢氧化钠；泳道4：20 g/L氢氧化钠； 泳道5：30 g/L氢氧化钠
图1 优化方法中显影液的氢氧化钠剂量对检测效果的影响
2.2 灵敏度实验和基因多样性检测
用优化的方法和文献中方法（Benbouza et al. 2006）分别对DNA marker DL2000和D18S51基因座PCR扩增产物进行检测，结果显示两种银染色检测方法具有相同的DNA检测灵敏度，均大约为5 ng（图2），来源于6个不同人体血液DNA为模板得到的D18S51基因PCR扩增产物在检测后也显示较好的多态性（图3）。
3 讨论
银染检测技术被广泛应用于聚丙烯酰胺凝胶中DNA的检测，本研究主要对Benbouza等人2006年建立的银染检测方法进行优化，省去了固定步骤，减少了部分染色液中硝酸银和显色液中氢氧化钠的用量，在终止显色反应时，仅仅用蒸馏水直接代替由10%乙醇和0.5%醋酸混合组成的终止显色溶液，检测更加快速，结果可在15~20 min内获得，此外，染色液的硝酸银用量被降低至1.0 g/L，在其他文献中一般介于1.5~2.0 g/L[10-11]。在碱性环境下，甲醛能够选择性地还原硝酸银，使之生成金属银并结合到核酸上去[12-13]，笔者在以往实验中还发现，凝胶在由氢氧化钠产生的碱性环境下显色比在碳酸钠产生的碱性环境下显色时所产生的凝胶背景更易控制，笔者在图1中还发现足够浓度的氢氧化钠对于获取背景清晰的DNA条带很重要，本优化方法中显影液的碱性环境选取由氢氧化钠产生，其剂量被减少至10 g/L，在其他文献中，其浓度一般为15~30 g/L[5,14]。本优化的DNA银染检测技术在操作时只需较少的实验步骤，操作简单、快速和便宜，并具有较高的灵敏度，适合在常规实验室中进行聚丙烯酰胺凝胶中DNA多态性的检测。
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[参考文献]
[1] Zhang YJ, Lee JB. Genetic polymorphism of Y-chromosomal STR loci in South Korean population [J]. Forensic Science International,2007,173(2):225-230.
[2] Ruiz C, Paz BM, Asins MJ. A quick methodology to identify sexual seedlings in citrus breeding programs using SSR markers [J]. Euphytica,2000,112(1):89-94.
[3] 张龙岗,杨建敏,刘相全.短蛸AFLP分子标记分析体系的优化与建立[J].生物技术通报,2010,(5):183-188.
[4] Beidler JL, Hilliard PR, Rill RL. Ultrasensitive staining of nucleic acids with silver [J]. Anal Biochem,1982,126(2):374-380.
[5] Benbouza H, Jacquemin JM, Baudoin JP. et al. Optimization of a reliable, fast, cheap and sensitive silver staining method to detect SSR markers in polyacrylamide gels [J]. Biotechnol Agron Soc Environ,2006,10(2):77-81.
[6] Cong WT, He HZ, Zhu ZX, et al. Improved conditions for silver-ammonia staining of DNA in polyacrylamide gel [J]. Electrophoresis,2010,31(10):1662-1665.
[7] Byun SO, Fang Q, Zhou H, et al. An effective method for silver-staining DNA in large numbers of polyacrylamide gels [J]. Anal Biochem,2009,385(1):174-175.
[8] Bassam BJ, Gresshoff PM. Silver staining DNA in polyacrylamide gels [J]. Nature Protocols,2007,2(11):2649-2654.
[9] 赵书平,张俊洁,尤建,等.一种碘化钾提取外周血基因组DNA 的方法[J].中华医学遗传学杂志,1999,16(6):395-396.
[10] Merril CR, Goldman D, Sedman SA, et al. ultrasensitive stain for proteins in polyacrylamide gels shows regional variation in cerebrospinal fluid proteins [J]. Science,1981,211(16):1437-1438.
[11] Caetano AG, Gresshoff PM. Silver: an alternative to radioisotopic and fluorescent labeling [J]. Promega Notes Magazine,1994,45(10):13-20.
[12] Bassam BJ, Anolles GC, Gresshoff PM. Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels [J]. Anal Biochem,1991,196(25):80-83.
[13] Sanguinetti CJ, DiasNeto E, Simpson AJ. Rapid silver staining and recovery of PCR products separated on polyacrylamide gels [J]. Biotechniques,1994,17(5):914-921.
[14] Creste S, Tulmann NA, Figueira A. Detection of single sequence repeat polymorphisms in denaturing polyacrylamide sequencing gels by silver staining [J]. Plant Molecular Biology Reporter,2001,19(8):299-306.
（收稿日期：2011-03-07）
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