咖啡酸在大鼠体内的绝对生物利用度及其在肠道吸收特性的研究
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[摘要] 目的：研究咖啡酸在大鼠体内的绝对生物利用度及其在肠道的吸收特性。方法：大鼠分别采用静脉（2 mg・kg-1）、灌胃（10 mg・kg-1）给药研究咖啡的绝对生物利用度；建立大鼠原位肠血管灌流模型研究咖啡酸在肠道的吸收率；采用Caco-2细胞模型研究咖啡酸的双向转运情况。结果：咖啡酸静脉（2 mg・kg-1）、灌胃（10 mg・kg-1）给药后，在大鼠体内的药动学行为均符合二室模型，咖啡酸的绝对生物利用度为14.7%；咖啡酸在肠血管灌流模型中的吸收率为12.4%；咖啡酸的PappAPBL及PappBLAP不随浓度的变化而变化，且在实验浓度的范围内，PappBLAP/PappAPBL均大于2。结论：咖啡酸绝对生物利用度低，肠道吸收率少，在Caco-2细胞单层模型中的转运途径可能为主动转运。
[关键词]咖啡酸；生物利用度；肠吸收率；通透性
咖啡酸（3， 4-二羟基肉桂酸）是自然界中分布非常广泛的多酚类化合物，具有抗氧化、抗菌、抗癌等作用[1-3]。有研究报道，每天摄食一定量的咖啡酸可以预防肝癌、皮肤癌[4-5]。咖啡酸是咖啡酸片主要成分，临床上用于止血。据报道咖啡酸的代谢部位主要是小肠，经肠道细菌代谢[6]。咖啡酸在大鼠血浆中代谢物主要是葡醛酸结合物、硫酸结合物及少量的原型药物[7]。少有文献报道咖啡酸的绝对生物利用度，因此，本文采用传统的体内法研究咖啡酸在大鼠体内的绝对生物利用，建立大鼠原位肠血管灌流法研究咖啡酸的肠吸收率及运用Caco-2细胞模型研究咖啡的通透性，旨为咖啡的临床应用提供理论指导。
1材料
咖啡酸（110885-200102）、肉桂酸（110786-200503）购自中国食品药品检定研究院；牛血清白蛋白购自齐云生物技术有限公司；DMEM 培养基、胎牛血清、非必需氨基酸购自美国Hyclone 公司；L-谷氨酰胺、胰蛋白酶，购自美国Sigma 公司。乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。
血管灌流Krebs-Ringer′s 液的配制：称取NaCl 7.8 g，KCl 0.35 g，CaCl2 0.37 g，MgCl2 0.22 g，NaH2PO4 0.32 g，葡萄糖 3.0 g，NaHCO3 1.37 g，蒸馏水定容至1 L，临用前加入5%牛血清白蛋白。HBSS溶液的配制：称取8 g NaCl，0.4 g KCl，1 g 葡萄糖，60 mg KH2PO4，47.5 mg Na2HPO4，调pH至7.2，加蒸馏水定容至1 L。
4000Q TRAP 串联四极杆质谱仪（美国Applied Biosystem 公司）；LC-20AD 高效液相色谱仪（日本岛津公司）；细胞培养箱（德国Hearous 公司）；24 孔Transwell培养板（美国Costar 公司）；Millicell-ERS跨膜电阻仪（美国Millipore 公司）；飞鸽高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；HL-2D 恒流泵（上海精科实业有限公司）。
SD 大鼠，雄性，体质量200～250 g，购自广州中医药大学实验动物中心，许可证号SCXK（粤）2008-0020。
2方法
2.1分析方法
2.1.1色谱条件 色谱柱为Phenomenex C18柱（2.0 mm×50 mm，5 μm），柱温30 ℃；流动相A 为甲醇-水（5∶95）和10 mmol・L-1醋酸铵，流动相B为甲醇-水（95∶5）和10 mmol・L-1醋酸铵；梯度洗脱程序如下：0～0.5 min，0%B；0.5～0.8 min，0～100%B；0.8～3.0 min，100%B；3.0～3.2 min，100%～0 B；3.2～5.0 min，0%B；流速0.2 mL・min-1；进样量10 μL。
2.1.2质谱条件 ESI离子源；MRM检测模式；检测离子为负离子[M-H]-；离子源温度550 ℃；离子喷雾电压-4 500 V；Gas 1为0.379 MPa；Gas 2为0.379 MPa；气帘气压0.138 MPa；咖啡酸和内标肉桂酸的检测离子对分别为m/z：178.9/134.8，146.8/102.8。
2.2咖啡酸体内药动学考察
12只SD大鼠随机平均分成2组，分别为静脉注射组和灌胃组。静脉注射组大鼠按2 mg・kg-1于股静脉注射给药，并与给药后0.083，0.167，0.5，1，2，3，5，8，12 h 眼球后静脉丛采血0.5 mL。灌胃组大鼠按10 mg・kg-1的剂量灌胃给予咖啡酸，于给药后0.083，0.167，0.333，0.5，1，2，3，4，6，12 h 眼球后静脉丛采血0.5 mL。分离血浆，甲醇溶液沉淀蛋白后低温保存（-20 ℃）待测。
2.3大鼠原位肠血管灌流模型制备与检测
大鼠原位肠血管灌流模型在原位肠肝血管灌流模型的基础上稍作修改[8-10]。大鼠20%乌拉坦（0.6 mL・kg-1）麻醉后，腹部切口，结扎腹腔动脉与肝动脉，将上肠系膜动脉、右肾动脉和腹主动脉游离出来，用线围绕主动脉与右肾动脉和上肠系膜动脉分支处上下松结扎，右肾动脉在靠近右侧肾门处扎紧，在进入上肠系膜动脉前一点做一切口用于插管，插管固定后立即开通灌流，体积流量5 mL・min-1。随即幽门静脉上作一切口，插管，固定插管后将体积流量提高至10 mL・min-1。将上述松结扎处扎紧，并在心脏与肝脏之间，结扎下腔静脉。用加热灯泡维持模型温度在37 ℃左右，先用不含药的灌流液冲洗干净血管中的残血，随后用含药的灌流液灌流，预平衡15 min。其后，换用100 mL 灌流液进行灌流，此时作为实验的零时间点并同时在十二指肠给予咖啡酸5 mg・kg-1，分别于0，5，15，30，45，60，75，90，105，120 min 从储备瓶中采样1 mL，并同时补充相同体积的灌流液，测定灌流液中咖啡酸的浓度。咖啡酸肠道吸收率采用如下公式计算：肠吸收率=×100%。Cend为120 min时咖啡酸在储液瓶中的浓度，mg・L-1；D为咖啡酸的初始浓度；100为灌流液的体积。
2.4Caco-2细胞模型
2.4.1细胞培养 Caco-2 细胞（传代≤40代）接种于培养瓶中，DMEM培养液内含10%胎牛血清、1%非必需氨基酸、1% L-谷氨酰胺、100 U・mL-1青霉素以及100 mg・L-1链霉素），细胞于5% CO2、相对湿度为90%， 37 ℃条件培养。将对数生长的细胞按6×104个/cm2密度接种于Transwell 培养板上，用于细胞转运实验。接种后隔天换液，1周后，每天换液。培养至21 d，以电阻值作指标进行验证，选取细胞跨膜电阻大于500 Ω・cm2。
2.4.2转运试验 用HBSS溶液配制质量浓度为5， 10， 15 μg・L-1的咖啡酸溶液，经过虑除菌，用空白HBSS溶液冲洗Transwell板3遍，放培养箱中培养30 min。对于从apical（肠腔侧，AP侧）到basolateral （基底侧，BL侧）转运：将药物溶液0.5 mL 加到AP侧作为供给池，同时BL侧加入1.5 mL空白HBSS溶液作为接收池；对于从BL侧到AP侧转运：将药物溶液1.5 mL 加到AP侧作为供给池，同时BL侧加入0.5 mL空白HBSS溶液作为接收池。将Transwell板置于37 ℃振摇孵育，与给药后120 min吸取100 μL 接收液，每组实验平行3份，结果以±s表示。表观渗透系数（Papp）及外排率的计算公式如下。
3结果
3.1分析方法验证
在本试验条件下，咖啡酸和肉桂酸的检测灵敏度高，分离度良好，R>1.5，二者典型的LC-MS/MS色谱图见图1。分别用空白血浆、灌流液、HBSS溶液配制咖啡酸的2个系列的对照品溶液，以待测物质量浓度（X）为横坐标，待测物与内标的峰面积比值（Y）为纵坐标，求得回归方程见表1。分别采用空白血浆、灌流液、HBSS溶液配制低、中、高3种质量浓度咖啡酸对照品，对分析方法的精密度、准确度、回收率及稳定进行考察，结果均符合生物样品分析要求。
3.2咖啡酸大鼠体内的药动学考察
大鼠股静脉注射、灌胃给药后，HPLC-MS/MS测定其血浆咖啡酸的浓度变化，得平均血药浓度-时间曲线，见图2。采用3P97软件处理血药浓度值，用房室模型和统计矩法计算药动学参数。Cmax，tmax以实测值计算，AUC按梯形面积计算，时间范围取0～∞ h，见表2。
3.3大鼠原位肠血管灌流模型考察咖啡酸的肠吸收率
大鼠十二指肠给药5 min后，灌流液中咖啡酸的质量浓度为（255.0±58.89） μg・L-1，给药60 min 后，灌流液中的药物的质量浓度为（1 179.0±118.2） μg・L-1，随后，灌流液中的药物浓度变化趋势平缓直至到实验结束。大鼠原位肠血管灌流模型测定咖啡酸的肠吸收率为12.4%。
3.4咖啡酸在Caco-2细胞模型的双向转运
不同浓度的咖啡酸HBSS溶液在Caco-2细胞模型的双向转运的结果见表3。由结果可知随着浓度逐渐增大，双向转运的表观渗透系数几乎保持不变，咖啡酸10，15 μg・L-1的PappAB，PappBA与咖啡酸的质量浓度5 μg・L-1的表观渗透系数没有显著性差异。双向转运的结果显示，在考察的浓度范围内PappAB>PappBA，推测咖啡酸可能是P-gp的底物。
4讨论
咖啡酸是苯丙素类化合物中的简单苯丙素类天然化合物。苯丙素类化合物在自然界中分布非常广泛，包括简单苯丙素、香豆素、木脂素、木质素、黄酮类等天然芳香族化合物。苯丙素类化合物是一类具有生物活性的化学成分。药物的结构在一定程度上影响着其在体内的吸收特性。游离香豆素、黄酮类化合物脂溶性较大，易于吸收，主要通过被动扩散方式透过生物膜[8]。陈炳銮[9]验证了9种黄酮类化合物在Caco-2细胞模型上的吸收均以被动扩散。苷类化合物因极性大，不易被直接吸收，黄酮苷类则经载体或水解成苷元后吸收[10]。简单苯丙素类以咖啡酸、桂皮酸、对羟基桂皮酸、阿魏酸等为常见。阿魏酸的脂溶性较咖啡酸大，有研究[11]发现阿魏酸在Caco-2细胞模型中具有良好的转运，大鼠体内绝对生物利用度达64.91%。咖啡酸极性大，灌胃后绝对生物利用度低，为14.7%。为了更进一步地探讨咖啡酸生物利用度的缘故，本实验设计了原位肠血管灌流法研究咖啡酸的肠吸收率及在Caco-2细胞模型的基础上考察咖啡的通透性。1985年，Pang等[12]首次提出肠肝血管灌流模型并将其用于研究依那普利的肠吸收率。王素军等[13]对肠肝血管灌流模型的灌流液成分进行优化。原位肠血管灌流模型的优点是可以根据实验研究目的的需要，改变实验的影响因素，考察各种因素对实验结果的直接影响，且该模型可以更直接地了解药物具体的肠吸收率。咖啡酸的肠吸收率较低，12.4%。该数值与传统的动物体内实验获得的绝对生物利用度14.7%相近，更进一步地验证了原位肠血管灌流模型的实用性、可靠性。当药物正向转运的Papp10×10-6 cm・s-1，则认为吸收良好，吸收为70%～100%[14]。由表3可知，咖啡酸是在Caco-2细胞模型的通透性差，为吸收差的药物，其在实验研究的浓度范围内，外排率皆大于2，推测咖啡酸可能为P-gp的底物，且在Caco-2细胞模型中的转运途径可能以主动转运。
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Absolute bioavailability of caffeic acid in rats and its
intestinal absorption properties
ZENG Jie1， WANG Su-jun1*， YANG Ben-kun1， ZHONG Yun-ming1， ZANG Lin-quan1， WANG Ling-li2
（1.Clinical pharmacy Department of Guangdong Pharmaceutical University， Guangzhou 510006， China；
2.Mathematical Engineering Institute of Dongguan Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine，
Guangdong 523808， China）
[Abstract] Objective： To investigate the absolute bioavailability of caffeic acid in rats and its intestinal absorption properties. Method： The absolute bioavailability （Fabs） of caffeic acid was obtained after iv （2 mg・kg-1） or ig （10 mg・kg-1） administration to rats. The intestinal absorption of caffeic acid was explored by the recirculating vascularly perfused rat intestinal preparation. Caco-2 cell model was applied to measure the permeability of caffeic acid from apical to basolateral said （A-B） and from basolateral to apical said （B-A）. Result： A two-compartment pharmacokinetic model was best to describe the pharmacokinetics of caffeic acid following iv or ig administration. The Fabs of caffeic acid was 14.7%， and its intestinal absorption was 12.4%. The values of Papp ABand Papp BA of caffeic acid were retained stable while its concentration was changed. The efflux ratio values in this study surveyed were above 2.0， and suggesting caffeic acid was active transport. Conclusion： Caffeic acid was shown to have poor permeability across the Caco-2 cells， low intestinal absorption and low oral bioavailability in rats.
[Key words] caffeic acid； bioavailability； intestinal absorption； permeability
doi：10.4268/cjcmm20132333