HPLC测定覆盆子中鞣花酸、黄酮和覆盆子苷―F5的含量

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[摘要]该研究建立了hplc-UV同时测定覆盆子药材中鞣花酸、异槲皮苷、山柰酚-3-O-β-D-芸香糖苷、椴树苷和山柰酚含量以及HPLC-ELSD测定覆盆子苷-F5含量的方法。实验结果表明，各化合物的标准曲线线性关系良好（R2 >0.999 5），检测限为0.297～90.144 ng，定量限为0.990～300.480 ng，加样回收率为97.11%～101.7%（RSD≤2.1%）。不同产地覆盆子药材中各化合物的含量差异较大，其中鞣花酸的产量与纬度呈正相关，总黄酮含量在东部产地药材中较高，且覆盆子苷-f5含量在安徽亳州药材中最高。该研究建立的方法简便、准确、灵敏、重复性好，为覆盆子药材的进一步研究开发，品质评价和质量控制提供了科学依据。

[关键字]覆盆子；含量测定；鞣花酸；黄酮；覆盆子苷-F5

[收稿日期]2013-06-06

[通信作者]* 郭美丽，Tel/Fax：（021）81871302， E-mail：

[作者简介]何建明，硕士研究生，E-mail： 中药覆盆子（Rubi Fructus）为蔷薇科悬钩子属植物掌叶覆盆子Rubus chingii Hu的干燥未成熟果实，具有益肾、固精、缩尿之功效，用于肾虚遗尿、小便频数、阳痿、遗精滑精等[1]。现代研究表明，覆盆子主要成分有鞣质、萜类、黄酮等，药理作用主要有抗诱变作用，改善学习记忆能力，延缓衰老，增强免疫，对性腺轴有调控作用等[2]。鞣花酸为覆盆子中鞣质的主要成分，具有良好的抗炎、抗诱变和抗菌作用等[3-5]。异槲皮苷，山柰酚-3-O-β-D-芸香糖苷，椴树苷和山柰酚为覆盆子中黄酮类的主要成分，药理学研究表明，其均具有抗氧化，抗炎等作用[6-9]。覆盆子的化学成分研究已经发现7个半日花烷型二萜苷，其主要成分为覆盆子苷-F5。目前《中国药典》2010年版对覆盆子药材的质量控制方法尚不完善，还没有定量检测的方法和指标。本文以鞣花酸、异槲皮苷，山柰酚-3-O-β-D-芸香糖苷，椴树苷，山柰酚和覆盆子苷-F5为指标，建立了HPLC同时测定其含量的方法，并对不同产地覆盆子样品进行了含量测定，旨在为覆盆子的资源开发以及质量评价和控制提供科学依据。

1材料

安捷伦1100系列高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；SEDEX 85型蒸发光散色检测器（法国SEDERE公司）；SB 25-12DTD超声清洗器机（宁波新芝生物科技有限公司）；TL-5.0W台式离心机（上海离心机械研究所）；METTLER AE 240 1/10 万电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司）。乙腈为色谱纯（杰帝贝柯化工产品贸易（上海）有限公司），水为重蒸水，其他试剂均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司），鞣花酸（批号11053121，纯度为98.8%）购于上海同田生物技术有限公司，异槲皮苷（批号111809-201001，纯度为99.5%）购于中国食品药品检定研究院，山柰酚-3-O-β-D-芸香糖苷、椴树苷、山柰酚和覆盆子苷-F5均由本实验室分离纯化得到，其结构经波谱鉴定，数据与文献报道一致[10-12]，HPLC检测纯度均大于99.5%。

覆盆子未成熟果实分别采摘于浙江馨昌、贵州遵义、安徽亳州等16个产地，均为由绿变绿黄时采摘、60℃干燥，经第二军医大学药学院郭美丽教授鉴定为掌叶覆盆子R. chingi的干燥未成熟果实。

2方法与结果

2.1对照品溶液的制备分别精密称取真空干燥至恒重的鞣花酸（20.56 mg），异槲皮苷（2.04 mg），山柰酚-3-O-β-D-芸香糖苷（5.23 mg），椴树苷（3.96 mg），山柰酚（2.04 mg）置于50 mL量瓶中，称取真空干燥至恒重的覆盆子苷-F5（6.26 mg）于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，经 0.45 μm 微孔滤膜过滤，即得鞣花酸质量浓度为0.411 2 g・L-1，异槲皮苷0.040 8 g・L-1，山柰酚-3-O-β-D-芸香糖苷0.1046 g・L-1，椴树苷0.079 2 g・L-1，山柰酚0.040 8 g・L-1的混合对照品溶液和质量浓度为0.250 4 g・L-1的覆盆子苷-F5对照品溶液。

2.2供试品溶液的制备不同产地掌叶覆盆子的干燥未成熟果实，置电热恒温鼓风干燥箱中60 ℃ 干燥至恒重，研细，过40目筛，精密称取2.50 g置于具有塞锥形瓶中，精密加入50 mL 70%甲醇，超声30 min，3 000 r・min-1离心10 min，移除上清液，再重复上述操作1次，合并上清液，减压浓缩，移至50 mL量瓶，70%甲醇稀释至刻度，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液为测定鞣花酸和黄酮含量的供试品溶液。精密量取上述供试品溶液30 mL，减压浓缩，移至10 mL量瓶中，70%甲醇稀释至刻度，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液为测定覆盆子苷-F5含量的供试品溶液。

2.3色谱条件Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱温30 ℃。HPLC-UV同时测定鞣花酸和黄酮时，流动相乙腈（A）-水 （含0.1%乙酸，B），梯度洗脱，0～16 min，12%～20% A； 16～35 min，20%～44% A。流速为1 mL・min-1，进样量为20 μL，测定波长为265 nm。在此条件下，5个化合物的保留时间在35 min以内，色谱峰分离度均大于1.5。HPLC-ELSD测定覆盆子苷-F5时，流动相乙腈（A） -水（B），梯度洗脱，流速为1 mL・min-1，0～5 min，75%～69% A； 5～12 min，69%～65%A。进样量20 μL，ELSD 检测器漂移管温度40 ℃，以洁净干燥的压缩空气为雾化气体，压力0.35 MPa，色谱图见图1。

A. 混合对照品（鞣花酸和黄酮）；B. 对照品（覆盆子苷-F5）； C. 供试品（鞣花酸和黄酮含量测定）；D. 供试品（覆盆子苷-F5测定）；1. 鞣花酸；2. 异槲皮苷；3. 山柰酚-3-O-β-D-芸香糖苷；4. 椴树苷；5. 山柰酚；6. 覆盆子苷-F5。

图1对照品和供试品HPLC图

Fig.1HPLC chromatograms of references and samples

2.4线性关系考察，检测限和定量限分别精密量取0.5，1，2，4，6，8，10 mL的混合对照品溶液置于10 mL量瓶，精密称取0.5，1，2，3，4，5 mL覆盆子苷-F5对照品溶液置于5 mL量瓶，用甲醇稀释至刻度，按2.3项中色谱条件进行HPLC分析，以峰面积Y为纵坐标，对照品进样量X为横坐标，计算鞣花酸，异槲皮苷，山柰酚-3-O-β-D-芸香糖苷，椴树苷和山柰酚的线性回归方程；以峰面积的自然对数值ln（Y）为纵坐标，对照品进样量的自然对数值ln（X），计算覆盆子苷-F5的线性回归方程。

分别用甲醇将混合对照品和覆盆子苷-F5溶液稀释一系列浓度，按2.3项中色谱条件进行HPLC分析，信噪比为3时的浓度为检测限，信噪比为10时的浓度为定量限。目标化合物的线性回归方程，相关系数（R2），线性范围，检测限和定量限见表1，结果表明，各化合物在线性范围内进样量与峰面积线性关系良好，方法灵敏度高。

2.5精密度试验分别取混合对照品溶液和覆盆子苷-F5对照品溶液，进样20 μL，连续进样6次，在上述色谱条件下，测定相应化合物的峰面积。鞣花酸、异槲皮苷、山柰酚-3-O-β-D-芸香糖苷、椴树苷、山柰酚和覆盆子苷-F5峰面积的RSD分别为1.4%，0.55%，0.57%，2.9%，0.63%，1.9%，结果表明仪器的精密度良好。

2.6重复性试验取浙江馨安产地的覆盆子粉末5份，按2.2项操作，平行制备5份供试品溶液，按2.3项色谱条件测定，记录峰面积。鞣花酸，异槲皮苷，山柰酚-3-O-β-D-芸香糖苷，椴树苷，山柰酚和覆盆子苷-F5的峰面积的RSD分别为2.4%，1.9%，2.7%，0.66%，0.93%。结果表明，化合物峰面积的RSD均≤2.7%，本方法重复性良好。

2.7稳定性试验取一份覆盆子粉末（浙江馨安），按2.2项操作，制备供试品溶液，室温分别放置0，4，8，12，16，24 h，按2.3项色谱条件测定，记录峰面积。鞣花酸，异槲皮苷，山柰酚-3-O-β-D-芸香糖苷，椴树苷，山柰酚和覆盆子苷-F5峰面积的RSD分别为0.58%，0.95%，0.36%，0.62%，1.0%，2.3%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.8加样回收率试验分别精密称取鞣花酸（300.73 mg），异槲皮苷（16.01 mg），山柰酚-3-O-β-D-芸香糖苷（138.08 mg），椴树苷（97.89 mg）和山柰酚（5.68 mg）置于250 mL量瓶中，精密称取覆盆子苷-F5（22.14 mg）置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，经 0. 45 μm 微孔滤膜过滤，即得鞣花酸质量浓度为1 202.9 mg・L-1，异槲皮苷64.1 mg・L-1，山柰酚-3-O-β-D-芸香糖苷552.3 mg・L-1，椴树苷391.6 mg・L-1，山柰酚22.7 mg・L-1的混合对照品溶液溶液和覆盆子苷-F5质量浓度为885.6 mg・L-1的对照品溶液。称取已知含量的覆盆子（产地浙江馨安）药材样品9份，每份约1.25 g，分别加入1，2，3 mL混合对照品溶液，或1，2，3 mL覆盆子苷-F5对照品溶液，每个量3份，按2.2项方法进行样品处理后，按2.3项色谱条件测定，记录峰面积，计算加样回收率，结果见表2。结果显示，鞣花酸，异槲皮苷，山柰酚-3-O-β-D-芸香糖苷，椴树苷，山柰酚和覆盆子苷-F5的平均加样回收率分别为100.2%，97.11%，101.7%，99.20%，97.80%，98.37%，本方法准确度良好。

2.9样品测定分别称取16个产地覆盆子粉末，按2.2项操作制备供试品溶液，按2.3项方法进行分析，记录峰面积，测定药材中6个化合物的含量，结果见表3。

3小结和讨论

3.1样品前处理方法的选择本实验考察了不同提取方法、提取溶剂、料液比及提取次数对本研究测定的6个化合物提取率的影响。以甲醇为提取溶剂，考察提取方式（超声60 min提取2次，加热回流60 min提取2次，冷浸过夜）对被测化合物提取的影响，结果表明超声提取法提取较完全且方便快捷。用甲醇作为溶剂，超声提取2次（60 min/次），考察料液比（1∶10，1∶20，1∶30）对药材中被测化合物提取的影响，结果表明，料液比1∶20为较优提取条件。对比30%，50%，70%，90%甲醇及甲醇5个不同甲醇浓度，料液比为1∶20，超声重复提取2次（60 min/次）条件下，对6个化合物提取率的影响，结果表明70%甲醇5个被测化合物（鞣花酸、异槲皮苷、山柰酚-3-O-β-D-芸香糖苷、椴树苷和覆盆子苷-F5）的提取率最高，70%，100%甲醇提取时山柰酚的提取效率无差异，综合考虑其他被测化合物的提取效率，故选择70%甲醇为提取溶剂。对比提取时间（20，30，40，50，60 min）在70%甲醇为提取溶剂，料液比为1∶20，超声重复提取，2次条件下，对6个被测化合物提取的影响，结果表明提取时间大于30 min时与30 min对6个化合物的提取没有差异，故选择30 min为提取时间。另外以70%甲醇为提取溶剂，料液比1∶20，超声提取30 min的条件下，考察了重复提取次数（1，2，3次）对被测化合物提取的影响，结果表明第3次提取均检测不出6个被测化合物峰，结果表明2次能够高效、完全提取药材中的6种化合物。由于ELSD检测器的检测限较高，为了获得更好的检测效果，在测定覆盆子药材中覆盆子苷-F5时，将药材的提取液体积浓缩至1/3。

3.2紫外吸收波长的选择本研究对化合物分别进行190～600 nm波长扫描，鞣花酸，异槲皮苷，山柰酚-3-O-β-D-芸香糖苷，椴树苷和山柰酚的最大吸收波长分别为254，256，266，316，262 nm，且在265 nm各个化合物均有较好的紫外吸收，故选择265 nm为吸收波长。覆盆子苷-F5无紫外吸收，选择蒸发光散色检测器对其进行检测。

3.3分析条件的选择本实验考察了不同色谱柱包括Agilent Zorbax SB-C18 （4.6 mm×250 mm， 5 μm）， Hypersil ODS （4.6 mm×250 mm， 5 μm） 和 Diamonsal C18 （4.6 mm×250 mm， 5 μm） 对6种化合物分离的影响，结果表明Agilent Zorbax SB-C18 （4.6 mm×250 mm， 5 μm） 能够获得较好的峰形和分离度。

在同时测定鞣花酸、异槲皮苷、山柰酚-3-O-β-D-芸香糖苷、椴树苷和山柰酚的分离条件中，对比不同流动相系统对鞣花酸和黄酮分离效果的影响（甲醇-水系统，乙腈-水系统和甲醇-乙腈-水系统），结果表明乙腈-水系统为流动相时，色谱峰峰宽小，被测成分分离度较好；对比流动相添加甲酸和不添加酸对化合物峰形的影响，结果表明水相加入0.1%乙酸时，被测成分峰宽较窄。

在覆盆子苷-F5的色谱条件中，考察了ELSD检测器不同漂移管温度（40，60，80 ℃），不同增益值（2，4，6，8）对化合物分析的影响，结果表明，漂移管温度为40 ℃，增益值为4时，能够获得更好的峰形；对比不同流动相系统，及流动相加酸和未加酸对化合物分析的影响，结果表明乙腈-水系统（不加酸），能够获得平稳的基线和良好的分离度。

3.4结论本研究所建立的HPLC-UV同时测定掌叶覆盆子中鞣花酸和四个黄酮类化合物以及HPLC-ELSD测定覆盆子苷-F5的方法，分别在35 min和12 min内将目标化合物完全分离，方法简单、快速，精确度和灵敏度高，能够满足实际样品检测的需要。

如表3所示，各化合物在不同产地覆盆子药材样品中的含量差异较大。药材产地越往北（即纬度越高），其覆盆子中鞣花酸的含量越高，覆盆子中鞣花酸的产量有可能与光照时间长短有关；而东部产地（安徽、浙江、江西、湖北、福建）总黄酮含量普遍高于中西部产地（四川、贵州、湖南、广西），在同一纬度附近，越往西则总黄酮含量越小，如福建南平的含量高于湖南衡阳。在东部产地中，纬度越高其总黄酮的含量越大；同样在中西部产区中，纬度越高其总黄酮的含量越大。由此推测，覆盆子中总黄酮的量有可能与东西部气候差异及日照时间有关。但结果显示覆盆子中覆盆子苷-F5的含量在不同产地中差异较大，且无明显规律，在被测产地中安徽亳州中的含量最高而有些产地（如辽宁本溪、贵州遵义等）未被检出。

本文对16个不同产地覆盆子药材中鞣花酸，异槲皮苷，山柰酚-3-O-β-D-芸香糖苷，椴树苷，山柰酚和覆盆子苷-F5进行了含量测定，为覆盆子药材的进一步研究开发以及药材的品质评价和质量控制提供科学依据。

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