用高效液相色谱仪测定葡萄休眠芽的脱落酸含量

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摘要：以6年生“赤霞珠”葡萄的休眠芽为材料，应用高效液相色谱法测定葡萄休眠芽中的脱落酸(ABA)含量。葡萄休眠芽中的脱落酸用80％冷甲醇抽提，抽提液在石油醚和水相之间分配，后经过吡咯烷酮(PVP)净化和乙酸乙酯萃取，最后用甲醇、水作为流动相，在ODS－C18柱上进行分离，用紫外检测器在260nm波长下检测、鉴定。结果表明，高效液相色谱法检测赤霞珠葡萄休眠芽中内脱落酸，含量为2.177pμg・g1-。

关键词：脱落酸(ABA)；高效液相色谱法(HPLC)；葡萄；休眠芽

中图分类号：S663.1　文献标识码：A　文章编号：1002－2910(2007)03－O004－03

检测植物的内源激素主要有生物鉴定法，气相色谱法(GC)，酶联免疫法(ELISA)和高效液相色谱法(HPLＣ)。相对而言，高效液相色谱法灵敏度高、专一性强和重复性好，是理想的分析方法，目前应用较广泛。

葡萄冬芽的休眠与生长抑制物有关，堀居内昭发现，这种抑制物质是脱落酸(ABA)。于是笔者通过测定葡萄休眠芽内的脱落酸含量，研究休眠与内源激素的关系。

1　材料与方法

2004年12月30日于南阳市园林局植物园选取健壮成熟的“赤霞珠”葡萄(6年树龄)的休眠芽为试材，用岛津LC－10AT高效液相色谱仪检测。色谱条件为色谱柱ODS－C18柱；流动相中甲醇与水(1％醋酸)的比例为35：65(V/V)；检测波长在260nm处；柱温45℃；流速每分钟0.9ml；进样20tμL。

准确称取脱落酸的标准样品1.00mg于25ml容量瓶中，用甲醇(色谱纯)定容至25ml，配成0.4g／L的脱落酸标准母液。使用时再用甲醇配成不同浓度的脱落酸标准液。

葡萄休眠芽内脱落酸的提取工艺流程为：准确称取葡萄冬芽3.00g，研碎后加入80％甲醇40ml。抽滤时在漏斗中垫4层滤纸，以充分除去样品中的悬浮颗粒；乙酸乙酯萃取为等体积萃取；吡咯烷酮(PVP)的用量为0.6g，搅拌10分钟后抽滤。具体流程如下：

2　结果与分析

2.1　分析条件选择

吸收波长的选择。取脱落酸的标准溶液在紫外分光光度计上光谱扫描，在波长240－270nm处脱落酸有较高吸收峰。结合高效液相色谱分离条件下脱落酸与杂质峰的分离情况，选择在260nm处测定葡萄休眠芽脱落酸含量。

选择反相液相色谱法通常使用的流动相(甲醇：水)，并加入一定量的乙酸，使脱落酸以分子形态存在，这样检出的峰形好且不拖尾。经大量试验证明：对葡萄休眠芽的提取液来说，当甲醇与水的比例为35：65(V/V)时，脱落酸与邻近的杂质峰分离效果较好。

流动相的pH值为3.0时脱落酸处于分子状态，此时检出的峰形较好，不拖尾，同时考虑到ODS－C18柱的耐酸性和使用寿命，在流动相中加入1％的醋酸，使pH值为3.0。

分别在流速为每分钟0.85ml、0.90ml和1.00ml下进行分析。试验证明：流速为每分钟0.9ml条件下，脱落酸的峰形较好，分离度较高。发现柱温在45％时，检出峰分离好，因此选取柱温为45℃。

2.2　脱落酸的分离与测定

在上述液相色谱检测条件下，对脱落酸的标准液进行测定和分析，得出保留时间为3.479分钟，如图1所示。对葡萄休眠芽提取物中的脱落酸进行测定，相应的保留时间为3.432分钟，如图2所示。

分别以脱落酸的标准溶液25μg/L、30μg/L、35μg/L、40μg/L、45μg/L、50μg/L、55μg/L和60μg/L进样，计算峰面积(Y)和浓度(x)的一元线性回归方程。所得回归方程式为Y=48.83X+32.94，相关系数R=0.995。

2.3　回收试验

于0.5ml的样品提取液中，加入不同浓度的脱落酸标准溶液，用与样品相同的色谱条件进行回收试验，重复4次，结果平均回收率为92.48％，达到了内源激素分析测定所要求的回收率。

2.4　葡萄休眠芽的脱落酸含量

根据色谱图(图2)所对应的峰面积和回归方程，计算得知葡萄休眠芽的脱落酸含量为2.177μg・g-1(鲜重)。

3　小结与讨论

以甲醇为提取剂提取葡萄休眠芽中的脱落酸，通过石油醚净化，吡咯烷酮纯化，乙酸乙酯富集，用高效液相色谱分析，在以甲醇：水(35：65，V/V)为流动相，流速为每分钟0.9ml，检测波长为260nm的条件下，测定葡萄休眠芽中的脱落酸，方法简便、准确、快速，符合植物激素分析的要求。

本试验用80％甲醇提取脱落酸，用石油醚和乙酸乙酯做萃取溶剂。乙酸乙酯与甲醇互溶，而不溶于水，因此80％的甲醇提取液需要经过减压浓缩至接近水相后，再与乙酸乙酯进行萃取。脱落酸易溶于碱性溶液和甲醇而难溶于水，因而在对提取液进行减压浓缩时需要保留部分的甲醇溶液。当将提取液减压浓缩至原体积的1/3，并与乙酸乙酯萃取后，得到相对较好的分层效果。在萃取过程中若有轻微的乳化现象，可加入饱和的氯化钠溶液来破除乳化。在试验中，分别利用石油醚和吡咯烷酮去除葡萄休眠芽提取液中的各种色素和酚类物质。在碱性条件下，利用乙酸乙酯去除酯溶性杂质，再用乙酸乙酯富集，最后甲醇溶解并定容而得到样品溶液。样品前处理及用高效液相色谱仪分析测定时要特别注意提取剂和流动相的pH值。脱落酸在pH值8.0的条件下，是以离子状态存在；在pH值3.0的条件下是以分子状态存在。因此在试验中，用吡咯烷酮时，调节pH值至碱性，以减少脱落酸被吡咯烷酮吸附的量。而在利用乙酸乙酯进行萃取时，则调节pH值为8.0，使脱落酸易溶于碱水溶液中，取碱水相。再调节pH值为3，0使脱落酸处于分子状态，以减少脱落酸在水相中的分配，最后取乙酸乙酯相，从而提高了回收率。用高效液相色谱仪分析样品时，在流动相中加入1％的醋酸，使脱落酸以分子状态存在，此时检出的峰形较好。