电脉冲植物愈伤组织激活仪的研制及其应用

开篇：润墨网以专业的文秘视角，为您筛选了一篇电脉冲植物愈伤组织激活仪的研制及其应用范文，如需获取更多写作素材，在线客服老师一对一协助。欢迎您的阅读与分享！

摘 要: 微电流处理可以加强或调节植物自身微电流的作用，从而促进植物培养组织的生长和分化。系统地介绍了电脉冲植物愈伤组织激活仪（专利号: ZL200720090104.1）研制的系统设计原理、硬件系统设计和软件系统设计等情况。该仪器可用于植物生物技术相关领域的研究，处理的植物材料可以是细胞、花粉、叶片、叶柄、茎段或愈伤组织等外植体。

关键词: 植物； 组织培养； 微电流仪；生长； 分化

中图分类号：Q943．1 文献标识码：A 文章编号：1009－9980?穴2011?雪06－1117－05

Development and application of micro-electric current electro-enhancement instrument in tissue culture

WANG Bao-min， LI Ming，QIAO Xian-sheng，ZHAO Gai-rong，YU Hong，CUI Xue-chen，WANG He

（Zhengzhou Fruit Research Institute， Chinese Academy of Agriculture Sciences， Zhengzhou，Henan 450009 China）

Abastract: Micro-electric current could regulate and enhance the growth and differentiation of the plant cell， tissue and organ in vitro. The design principles， hardware and software system design， feature and technical parameters of the micro-electric current electro-enhancement instrument （patent number:ZL200720090104.1）are introduced in detail. It could be applied in plant biotechnology field. Plant materials include cell， pollen， leaf， petiole， stem or callus et al.

Key words: Plant； Tissue culture； Micro-electric current instrument； Growth； Differentiation

植物电生理是生命科学的一个重要研究领域，植物在整个生命活动进程中从个体、器官、组织、到细胞都伴有微电流的发生，生长越快，电流越强。外加微电流可以加强或调节植物自身微电流的作用，从而影响到植物培养组织的生长和分化。1985年，Rathore等[1-2]首先报道了微电流处理可以促进烟草愈伤组织的生长和芽的分化。微电流处理可以改变植物体内生长素的极性运输和分布[3]，促进植物细胞的生长和分化，可能与微电流产生电位梯度引起细胞成分的重新分布有关。以后的研究发现，微电流还可以提高苜蓿胚状体的发生率[4]，促进三叶草[5]和大豆属、梨属、茄属等植物[6]原生质体的分裂，促进小麦[7]和石防风[8]原生质体形成细胞团，促进芦笋小孢子胚性愈伤组织的形成[9]，促进百合叶片愈伤组织的形成和生长[10]。Colt原生质体悬浮液微电流处理后极为明显地促进了以后的愈伤组织生长量和愈伤组织再生芽能力[11]。并且，微电流处理再生芽的生长速度和生长势也要明显地优于未处理对照的再生芽。此外，微电流处理增加细胞透性，改善植物激素的作用效能，因而再生芽的生根能力也被显著促进提高了，表现在生根率、发根数量、根系生长量等方面。更进一步地研究发现，这种微电流处理效果可以在植物细胞内长期保存下去[12]。各种数据分析表明，微电流处理可能刺激、激活了那些与控制细胞生长和分化等有关的基因的有效表达。微电流处理有可能作为植物组织培养过程中调控植物生长发育的一条途径，研究微电流对植物细胞的影响，对调控植物生长发育，具有重要的意义。为此，研制出电脉冲植物愈伤组织激活仪（专利号: ZL200720090104.1），可用于植物生物技术相关领域的研究，处理的植物材料可以是细胞、花粉、叶片、叶柄、茎段或愈伤组织等外植体类型。本文系统地介绍了该仪器研制的系统设计原理、硬件系统设计和软件系统设计等情况，供相关领域的研究人员参考。

1 系统设计原理

电脉冲植物愈伤组织激活仪主要由机箱、电击槽、单片机、高压发生器、LED数码显示器等部分组成。该系统的工作原理: 将输出到电击槽上的脉冲电压、脉冲持续时间、脉冲间隔时间、脉冲次数等参数调整到设定值，将要处理的植物样品放入电击槽内，加入适量缓冲液。当按动开始键时，有一预设脉宽和幅值的电脉冲输出到达电击槽，对相应的植物样品进行激活处理。植物组织经过高压电脉冲的适量刺激，使植物细胞在微电流的作用下出现短暂可逆性的开放小孔，激活了细胞内有关的酶系统，并激活了那些与控制细胞生长和分化等有关基因的有效表达，从而促进植物培养组织的生长和芽的分化。

2 硬件系统设计

2.1 硬件系统组成

电脉冲植物愈伤组织激活仪由面板（4）、电击槽总成（7）、电路控制板等部分组成。面板（4）部分是由电压调整钮（1）、显示窗（2）、按键（3）构成（图1）。电击槽总成（7）部分由槽体，固定电极（5），可调电极（6），高压线，插槽等构成（图2）。电路控制部分是由电击槽电路（8）、电源（9）、高压电脉冲发生器（10）、键盘（11）、单片机（12）、显示器（13）、存储器（14）等构成（图3）。电路工作原理见图4。

2.2 硬件电路设计

2.2.1 单片机 电脉冲植物愈伤组织激活仪的核心就是单片机，其性能对整个系统性能有重要影响。为此选定STC89C51RC单片机，该单片机具有超强抗干扰、高速、低功耗的特点，其指令系统与MCS-51完全兼容，12时钟周期和6时钟周期可以任意选择，工作频率范围0～40 MHz，用户应用程序空间4 K字节，片上集成512字节RAM，通用I/O口32个，ISP（在线可编程）/IAP（在应用可编程），看门狗，通用异步串行口（UART）。此单片机可使系统更加稳定可靠的工作。

2.2.2 高压电脉冲发生器 高压电脉冲发生器由振荡源D、电压调节电位器RP、功率推动模块U7、升压电路T等组成，通过调节电位器RP可使输出的脉冲电压幅度在0～1000 V。由单片机的P1.0端控制反相器U9_2、三极管VT4推动光电耦合器U8触发高压开关管VT2，输出1～999 μs的电脉冲至电击槽。

2.2.3 数据存储器 数据存储器由U2构成，用于保存脉冲电压、脉冲持续时间、脉冲间隔时间、脉冲次数等参数。选用X5045数据存储器，具有512字节串行E2PROM、看门狗、低电源电压复位等特点。X5045的片选CS端和时钟端SCK、数据输入端SI、数据输出端SO分别与单片机的P3.0～P3.3口相连，实现数据的传送；X5045的复位端RST与单片机的复位端RST相连，实现了系统的开机复位和看门狗的喂狗复位，以防系统运行时出现死机。

2.2.4 显示器 显示电路由I/O扩展控制器U4（81C55）、8位反相缓冲器U5（74HC540）、8位同相缓冲器U6（74HC541）、7位LED数码管和3位半数字电压表M等电路组成。81C55的地址/数据线与单片机的P0口相连，74HC540用于位选、74HC541用于段选，其输入端分别与81C55的A口、B口相连，输出端分别与7位LED数码管的位和段相连。7位LED数码管用于显示脉冲持续时间、脉冲间隔时间、脉冲次数，3位半数字电压表M用以测定和显示脉冲电压。

2.2.5 键盘 5个按键由调位键K1、调数键K2、暂停键K3、停止键K4、开始键K5组成，和单片机的P1.1～P1.5口相连，用以调整各个参数和系统运行状态。

2.2.6 电击槽电路 电击槽电路由高压开关管VT2、高压线、固定电极（5）和可调电极（6）等组成。高压开关管VT2输出的高压线和地线分别连接至电击槽总成的固定电极和可调电极，通过调整可调电极与固定电极之间的距离，可改变对两电极之间的植物样品所施高压脉冲的强度。

2.2.7 声音提示 声音提示电路由反相器U9_1、U9_4、三极管VT1、VT5、单稳触发电路U1和蜂鸣器B1、B2等电路组成。当每输出一个电压脉冲时，即触发一次单稳电路使蜂鸣器B1发出一短促提示音。当脉冲次数显示为“0”时，由蜂鸣器B2发出4次鸣笛提示音以示工作结束。

3 软件系统设计

3.1 软件主流程图

电脉冲植物愈伤组织激活仪的软件系统采用汇编语言设计，承担电脉冲植物愈伤组织激活仪的脉冲电压、脉冲持续时间、脉冲间隔时间、脉冲次数等参数的设定和控制，数据转换、数据处理、界面显示、键盘操作、声音提示等功能。软件主流程图见图5。

3.2 设定程序设计

开机系统初始化后首先检测调位键K1是否按下，若调位键K1按下即进入设定程序。分别按动调位键K1、调数键K2，逐位输入脉冲持续时间、脉冲间隔时间、脉冲次数等各项预设参数，并由U2等电路组成的存储器将各项预设参数储存起来，同时由U4、U5、U6、LED数码管等电路组成的显示器将各项预设参数显示出来。部分设定程序如下:

SD:SETB TR0；开闪显

MOV R1，#36H

MOV R0，#46H

MOV R5，#07H

SD1:LCALL CSX；传数闪显

JNB P1.1，SD1；调位键抬起？

SD2:LCALL CSX

JB P1.2，SD6；调数键按下？

；

SD8:DJNZ R5，SD9；各项参数设完？

SJMP SD10

；

LCALL page_write；将设定的各项参数写入

串行E2PROM

；

SJMP YX；进入运行程序

3.3 运行程序设计

开机系统初始化后若调位键K1未按下即进入运行程序。首先将储存在串行E2PROM中的脉冲持续时间、脉冲间隔时间、脉冲次数等各项预设参数调入内存并显示。检测开始键K5是否按下，若未按下则处于待机状态；若开始键K5按下则判断脉冲持续时间、脉冲间隔时间、脉冲次数各项参数倒计时后是否有一项为0。若不为0则启动高压电脉冲开关输出一组有序的预设脉宽、间隔和次数的高压电脉冲输出到达电击槽，对相应的植物样品进行激活处理。脉冲次数和脉冲间隔时间均开始倒计时显示，并且每输出一次脉冲，均由蜂鸣器发出一鸣笛提示音。按动暂停键时，可使脉冲输出暂停，脉冲次数和脉冲间隔时间显示数字亦固定在当时值。当再次按动开始键时又继续工作，直至脉冲次数显示为“0”时，由蜂鸣器发出4次鸣笛提示音以示工作结束。在工作过程中，可根据需要随时按动停止键停止工作。部分运行程序如下:

YX:CLR TR0

MOV DPTR，#0000H

MOV R1，#46H

MOV R2，#07H

LCALL sequ_read；将保存在串行E2PROM

中的各项参数读出

；

YX1:JNB P1.1，SDZ ；调位键按下？

LCALL DIR；显示

JB P1.5，YX1；开始键按下？

MOV A，46H

JNZ YX2；脉冲持续时间为0？

MOV A，45H

JNZ YX2 ；脉冲间隔时间为0？

MOV A，44H

JNZ YX2 ；脉冲次数为0？

SJMP YX1

；

SETB TR1

CLR P1.0；放电

YX5:JNB TF1，YX5 ；脉冲持续时间到?

SETB P1.0；停止放电

；

JZ YX7；脉冲次数到?

DEC 51H

MOV 50H，#9

SJMP YX8

；

YX7:CLR P1.6 ；工作结束蜂鸣器打开

；

CJNE A，#1，YX9_3；脉冲间隔时间到？

MOV A，53H

JNZ YX9_2

CLR TR0

AJMP YX4

YX9_1:LCALL CCS_1

LCALL ML

LCALL DIR

SJMP YX8

；

4 实验结果

高压电脉冲发生器产生的脉冲直流电压为0～1 000 V，脉冲持续时间为1～999 μs，脉冲间隔时间为1～99 s，脉冲次数为1～99次，电击槽有效容积为20 mm×25 mm×（20～40） mm三档可调。将要处理的植物样品放入电击槽内，并将可调电极板预插到适当插槽中，加入适量缓冲液。将脉冲电压、脉冲持续时间、脉冲间隔时间、脉冲次数等各项参数调整到一个适当的数值上，经过高压电脉冲对植物样品的不断适当的刺激，使植物培养组织在微电流的作用下得到有效的激活，在适当的培养条件下经过一段时间的培养，便有可能影响到植物培养组织的生长和芽的分化。本课题组在樱桃亚属植物组织培养的离体再生研究中，已开始研究应用本仪器，初步实验结果表明微电流处理后樱桃叶片和愈伤组织分化再生芽的能力得到一定程度的提高。进一步的深入研究还在进行中。

参考文献 References:

[1] RATHORE K S，GOLDSWORTHY A. Electrical control of growth in plant tissue cultures[J]. Bio/Technology，1985，3: 253-254.

[2] RATHORE K S，GOLDSWORTHY A. Electrical control of shoot regeneration in plant tissue cultures[J]. Bio/Technology，1985，3: 1107 -1109.

[3] GOLDSWORTHY A，RATHORE K S. The electrical control of growth in plant tissue cultures: the polar transport of auxin[J]. Journal of Experimental Botany，1985，36: 1134-1141.

[4] DIJAK M，SMITH D L，WILSON T J，BROWN D C W. Stimulation of direct embryogenesis from mesophyll protoplasts of Medicago sativa[J]. Plant Cell Reports，1986（6）: 468-470.

[5] LI Z，TANNER G J，LARKIN P L. Callus regeneration from Trifolium subterraneum protoplasts and enhanced protoplast division by low-voltage treatment and nurse cells[J]. Plant Cell，Tissue and Organ Culture，1990，21: 67-73.

[6] RECH E L，OCHATT S J，CHAND P K，POWER J B，DAVEY M R. Electro-enhancement of division of plant protoplast-derived cells[J]. Protoplasma，1987，141: 169-176.

[7] DAI Qun，XIA Guang-min，GUO Guang-qin. Electro-enhancement of the formation of cell clusters from protoplasts of Tritium aestivum[J]. Acta Botanica Sinica，1995，37（2）: 162-164.

戴群，夏光敏，郭光沁. 微电流对小麦原生质体形成细胞团的促进作用[J]. 植物学报，1995，37（2）: 162-164.

[8] DAI Qun，KONG Wei-hua. Electro-enhancement of the number of cell aggregate derived from protoplasts of Peucedanum terebinthaceum[J]. Journal of Shandong University: Natural Science Edition，1996，31（1）: 90-93.

戴群，孔维华. 微直电流对石防风原生质体形成细胞团的影响[J]. 山东大学学报: 自然科学版，1996，31（1）: 90-93.

[9] DELAITRE C，OCHATT S，DELEURY E. Electroporation modulates the embryogenic responses of asparagus （Asparagus officinalis L.） microspores[J]. Protoplasma，2001，216: 39-46.

[10] SONG Xiao-yi. The effect of micro-direct current on the formation and the growth of Siberia Lilium callus[J]. Northern Horticulture，2010（6）: 138-140.

宋小义. 微电流对百合愈伤组织形成及生长的影响[J]. 北方园艺，2010（6）: 138-140.

[11] OCHATT S J，CHAND P K，DAVEY M R，POWER J B. Electroporation-mediated improvement of plant regeneration from colt cherry （Prunus avium× pseudocerasus） protoplasts[J]. Plant Science，1988， 54: 165-169.

[12] OCHATT S J，RECH E L，DAVEY M R，POWER J B. Long-term effect of electroporation on enhancement of growth and plant regeneration of colt cherry （Prunus avium×pseudocerasus） protoplasts[J]. Plant Cell Reports，1988（7）: 393-395.