原发性肝癌影像学特征与PCNA、AFP的表达

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[摘要] 目的：探讨原发性肝癌患者的CT与MRI影像表现特征，探讨用影像表现与pcna蛋白及血清afp阳性表达结果相对照，以判断肿瘤的生物学行为。方法：经手术切除并经病理证实的原发性肝癌29例作为研究对象，确诊的肝硬化27例作为对照。观察肝癌的CT或MRI表现特征，用电化学发光法检测血清AFP，免疫组织化学方法检测肿瘤细胞PCNA蛋白阳性表达率，并结合病理分级结果进行对照分析。结果：原发性肝癌PCNA的表达与病理分级相关，PCNA、AFP的表达与肿瘤大小和无包膜或包膜不完整均相关。原发性肝癌的增强类型与PCNA及AFP的阳性表达无明确关系。结论：原发性肝癌的CT和MRI影像中肿瘤体积增大及无包膜或包膜不完整在一定程度上反映肝癌的AFP、PCNA的表达，这些影像特征的出现提示肝癌恶性度高、易转移、预后不良。

[关键词] 原发性肝癌；增殖细胞核抗原；甲胎蛋白；体层摄影术；磁共振成像

[中图分类号] R81[文献标识码]A [文章编号]1673-7210（2008）05（c）-016-03

Correlation of the expressions of the imaging features and PCNA，AFP in primary hepatocarcinoma

DONG Jing-dong, WANG Li-fen

(Department of Radiology, the Second Affiliated Hospital of Dalian Medical University, Dalian 116027, China)

[Abstract] Objective: To investigate the relationship between the imaging findings on spiral computed topography and（or） magnetic resonance imaging and the expressions of proliferating cell nuclear antigen(PCNA) and serum alpha-feto-proteins(AFP) in primary hepatocarcinoma. To study the possibility of reflecting the change of hepatocarcinoma molecular biology with the imaging findings,PCNA and AFP. Methods:Twenty-nine cases with primary hepatocarcinoma（PHC）were verified by histopathology SCT and/or MRI scanning.We employed immunohistochemical technique to estimate the positive expression rate of PCNA in tumor specimens,and CLEIA to measure human AFP in serum. The relationship between the imaging features and the positive expression rate of PCNA and AFP was observed.Results: It showed that there was close correlation between the positive expression rate of PCNA and pathological grade. The positive expression rates ofPCNA and AFP were closely correlated with the diameter of lesion on image and incomplete pseudo-capsule. No correlation was found between the enhancement pattern and the expression of PCNA and AFP in hepatocarcinoma. Conclusion:Some SCT and MRI features of primary hepatocarcinoma such as the large tumor and incomplete pseudo-capsule may reflect the expression levels of PCNA and AFP. From these imaging features of the primary hepatocarcinoma, the bad behavior and poor prognosis can be predicted.

[Key words] Primary hepatocarcinoma; PCNA; AFP; CT; MRI

原发性肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一。我国每年新发病例约占全球的45％。影像学检查多层螺旋CT与MRI为肝癌的重要检测手段。增殖细胞核抗原（PCNA）是与细胞增殖周期密切相关的肿瘤性标志物，是衡量肿瘤增殖能力和恶性程度的重要指标之一。甲胎蛋白（AFP）是肝癌发生发展过程中表达的蛋白质，被认为是标志性蛋白而用于肝癌的早期诊断。本研究通过免疫组化方法检测29例肝癌组织中PCNA的表达及血清AFP的表达，并分析其影像学表现，旨在探讨影像学表现评价肝癌生物学行为的可行性。

1 材料与方法

1.1材料

选择2001~2006年在我院进行手术切除并经病理证实的原发性肝癌患者29例，其中，男21例，女8例，年龄31~80岁，平均52.5岁。按WHO病理学分类，共有肝细胞癌23例，胆管细胞癌6例；对照组为肝硬化患者27例。术前均行CT或MRI动静脉双期增强扫描。

1.2 CT与MRI检查方法及观察指标

使用Siemens Volum Zoom全身螺旋CT扫描机和1.5T超导型MR仪（Signa 1.5T,GE Medical System）。造影剂：Ultravist（300 mgI/ml），总量75~100 ml(1.5 ml/kg体重)；钆喷替酸葡甲胺（Gd-DTPA），总量20~30 ml(0.2~0.4 ml/kg体重)。经肘前静脉用压力注射器单相注入，注射速度2.0~2.5 ml/s。动静脉双期扫描具体时间分别为造影剂注射后，动脉期延迟20~30 s，静脉期延迟60~70 s。

CT与MRI图像观察指标：①肿瘤大小。分为直径≤5.0 cm和直径>5.0 cm两组。②包膜情况。分包膜完整和包膜不完整/无包膜两组。③强化类型。动脉期分均匀强化和不均匀强化两种类型。

1.3 免疫组化染色与AFP检测

标本均用10％中尔马林固定，石蜡包埋，4 μm连续切片，苏木精-伊红染色。免疫组化采用Elivision TM plus法。PCNA单克隆抗体以及免疫组化Elivision试剂盒为迈新生物技术公司产品。石蜡切片常规脱蜡水化处理，3％H2O2室温孵育15 min，将样品置于柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）中，抗原修复，PBS液冲洗样本。加羊血清，室温孵育，滴加一抗（PCNA单克隆抗体）,4℃冰箱过夜。滴加聚合增强物，室温下孵育20 min。PBS液冲洗样本，滴加酶标抗鼠/兔聚合物，室温下孵育30 min，DAB显色，水洗，苏木精复染30 s，脱水，透明，中性树胶封片。用PBS代替一抗作为阴性对照。

AFP采用电化学发光免疫双抗体夹心法定量检测。

1.4 结果判断

1.4.1苏木精-伊红染色结果判断肝癌的病理分级采用Edmondson法。Ⅰ级癌细胞呈高分化状态，类似正常肝细胞，细梁状排列；Ⅱ级癌细胞中度分化，形态接近正常肝细胞，但核/质比例增大，核染色深，胞质嗜酸性增加，出现假腺管形结构；Ⅲ级癌细胞分化较差，核体积与核染色变化均超过Ⅱ级，核异形明显，核分裂象多见，可见瘤巨细胞；Ⅳ级癌细胞分化最差，形状极不规则，高度异型的癌细胞占多数，胞质少，核染色浓染，细胞排列松散，梁索状结构不明显。本组中把Ⅰ、Ⅱ级划为高分化，Ⅲ、Ⅳ级划为低分化。

1.4.2 免疫组化结果判断PCNA表达于细胞核内，以胞核中出现棕黄色颗粒为阳性细胞。计数癌细胞中阳性细胞所占的比例，阳性细胞数≥30％为阳性组，

1.4.3 AFP结果判断血清AFP含量大于20 μg/L为阳性组（1 IU/ml=1.21 μg/L）。

1.5 统计学处理

所有资料均用统计软件包SPSS10.0处理，统计分析方法为确切概率法及χ2检验，P＜0.05为有显著性差异。

2 结果

本组29例原发性肝癌, 肝细胞癌23例，其中，高分化组8例，低分化组15例，PCNA阳性表达率分别是34.8%，65.2%。

2.1肝癌和肝硬化组PCNA、AFP的表达

由表1可见，肝癌组PCNA阳性表达率明显高于肝硬化组（P0.05）。

2.2肝癌组织学类型与PCNA、AFP表达的关系

由表2可见，肝细胞癌组和胆管细胞癌组之间PCNA的表达无统计学差异（P>0.05），而AFP的表达差异有显著性（P

2.3肝癌影像特征与PCNA、AFP表达的关系

由表3可见，>5.0 cm组肝癌的PCNA表达及血清AFP含量高于≤5.0 cm组（P

与≤5.0 cm组比较，a P=0.005, b P=0.045；与包膜完整组比较，c P=0.009, d P=0.001；与强化均匀组比较，e P=1.000，fP=0.633

3讨论

3.1 肝癌和肝硬化组PCNA、AFP的表达

PCNA是增殖细胞合成DNA所必需的白，又称周期蛋白，分子量为36 KD，是与细胞增殖周期密切相关的肿瘤性标志物，是衡量肿瘤增殖能力和恶性程度的重要指标之一。Mise等[1]研究发现肝癌组织分化低，恶性程度高，细胞增殖率高，PCNA阳性率显著增高。本组结果亦显示，肝癌PCNA的阳性表达率与病理分级呈负相关，说明肝癌中PCNA的表达可以反映肝细胞癌的分化程度。因此，采用以相应抗体作标记的PCNA免疫组织化学检测结果，可以作为判断和评价原发性肝癌的细胞增殖状态和生物学活性的指标。

AFP是原发性肝细胞癌的重要标志物。本组研究也显示AFP的表达与肝癌的组织学类型有关，在肝细胞癌中AFP的表达高于胆管细胞癌。在本组研究中，肝癌与肝硬化患者AFP的阳性表达率无显著性差异，这可能与AFP产生机制有关。除肝癌外，在生殖腺胚胎瘤、转移癌如胃癌以及孕妇、肝硬化患者血清AFP水平也可见升高。肝硬化血清AFP升高的原因主要是由于受损伤的肝细胞再生而重新具有产生AFP的能力。肝硬化患者血清AFP水平一般低于肝癌阳性患者。临床上，AFP检查诊断肝细胞癌的标准为：①AFP大于500 μg/L持续4周。②AFP由低浓度逐渐升高不降。③AFP在200 μg/L以上的中等水平持续8周。本组研究中肝癌与肝硬化患者AFP的阳性判定以患者术前或入院来血清中AFP测量平均最高值的检测结果来判定，没有行动态追踪观察，阳性取值域较低，这也是在本组研究中造成两者无显著性差异的原因。AFP异常体，临床上常遇到良性肝病的AFP值明显升高或原发性肝癌的AFP值偏低，因此根据血清AFP浓度难以鉴别良恶性肝病[2]。CT与MRI的影像检查可以发现肝内的占位性病变，有助于肝癌与肝炎肝硬化的鉴别诊断。

3.2 肝癌的影像特征与PCNA、AFP表达的关系

史光军等[3]研究认为肝癌DNA含量与瘤体大小之间有相关性，肿瘤直径≤5.0 cm DNA倍体值与>5.0 cm者差异有显著性，原发性肝癌在5.0 cm大小时可能是DNA含量及生物学特性发生转变的重要时期，＜5.0 cm者基本反映了早期肝癌相对良性的生物学指标。故本组病例将肝癌直径分为 ≤5.0 cm组与>5.0 cm组进行比较。结果显示，肿瘤直径>5.0 cm组，PCNA的阳性表达率增加，血清AFP的含量增加。随着肿瘤细胞的增殖活性增加，PCNA的表达率增高，肿瘤体积也随之增大，肿瘤细胞产生的AFP也增加。Nakae 等[4]研究发现增殖活性与患者的预后密切相关，增殖活性高的肿瘤，患者术后生存期相对较短。本结果提示，影像学上肝癌肿瘤的大小与癌细胞增殖活性密切相关，肿瘤细胞PCNA的表达及AFP的水平可反映肝癌的恶性生物学行为。

包膜在影像学上的显示高度提示肝细胞癌。肝癌病灶边缘与肿瘤生长方式密切相关，以膨胀性生长为主的肿瘤，边缘常较为清楚光滑，可见到包膜征，浸润性生长的肿瘤边界模糊，无包膜形成或包膜不完整。包膜在CT平扫图上表现为瘤边的低密度环状影，MRI T1WI对包膜的显示最为敏感，表现为边缘完整或不完整的低信号带，T2WI可为低或高信号。侵袭性生长的肝癌细胞增殖活跃，生长迅速，易于向周围组织浸润，不易形成反应性纤维包膜。肝癌细胞所表达的AFP具有既能抑制免疫系统又能促进瘤细胞生长的双重作用。因此血清AFP含量的增加也反映肿瘤细胞生长活跃，不容易形成完整的包膜。于继徐等[5]研究认为，肿瘤包膜完整者细胞凋亡率要高于包膜不完整者，而细胞增殖率低于包膜不完整者，从而可推测包膜完整者预后好于包膜不完整者。本组结果显示，包膜不完整组PCNA及AFP表达率高于包膜完整组，提示包膜不完整组肝癌恶性程度高、预后差。

肝癌的血供与正常肝脏差别很大。正常肝脏主要由门静脉供血，而肝细胞癌90％由肝动脉供血，肿瘤血管的异常形成使得增强扫描早期即动脉期，病灶即刻出现强化。肿瘤新生血管的出现改变了增强扫描时肿瘤的强化特征[6]。本组研究中，肿瘤的强化类型与PCNA及AFP的表达无相关性，考虑是由于增强扫描主要反映肿瘤血管生成的情况，与肿瘤血管生成因子有密切关系，而PCNA、AFP主要反映肿瘤细胞的增殖情况。

原发性肝癌患者预后的影响因素众多，其中某些因素可能有相互协同作用或混杂效应。原发肿瘤大小、数目、有无肝内转移、肝功能分级及肿瘤的生物学特征、生长因子的表达水平是影响肝癌预后的主要因素。CT与MRI动态增强的应用，使影像学不仅仅局限于对病灶形态学的描述，还能对病灶的功能性特征进行分析，有助于在影像学上对肝癌的生物学行为的判断提供参考指标，对术前或不能手术的患者提供可重复性的、无创性的检测手段，并为合理的、最有价值的治疗方案的选择提供依据。

[参考文献]

[1]Mise K, Tashiro S, Yogita S,et al. Assessment of the biological m alignancy of hepatocellular carcinoma: relationship to clinico-pathological factors and prognosis [J].Clin Cancer Res,1998,4(6):1475

[2]叶任高，陆再英.内科学[M].第6版.北京：人民卫生出版社，2006.453.

[3]史光军，胡义利，赵宜仁.原发性肝癌DNA含量与核形态学参数关系的分析及其临床意义[J].肝胆外科杂志，1997, 5(4):233-235.

[4]Nakae S, Nakamura T, Ikegawa R, et al. Evaluation of argyrophilic nucleolar organizer region and proliferating cell nuclear antigen in colorectal cancer[J]. J Surg Oncol, 1998,69(1):28.

[5]于继徐，王滨，高志芹，等.肝癌细胞凋亡和增殖与CT表现的相关研究[J].实用放射学杂志，2003，19（1）：1－4.

[6]熊壮.评价肿瘤血管生成的影像方法[J].国外医学临床放射学分册，2004，27（2）：65－68.

（收稿日期：2008-03-11）

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