鼻腔灌洗液在呼吸道疾病研究中的运用

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鼻腔是呼吸道最先接触外来空气污染物的部位，在组织学上，鼻黏膜与气管及支气管黏膜很相似。因此，鼻腔黏膜细胞组织的炎症过程可反映或影响下呼吸道的炎性反应。鼻腔灌洗液（nasal lavage fluid，NLF）中所观察到的暴露、效应等生物标志物与支气管肺泡灌洗（bronchoalveolar lavage，BAL）基本一致［1］

20世纪90年代以来，国内外学者通过检测NLF中的成分，研究呼吸道过敏性疾患及有毒有害刺激性气体对呼吸系统的危害。NLF的检测可间接或直接反映呼吸道的病理变化，可广泛应用于大气污染、有害气体及环境变应原等相关的呼吸系统疾病中。NLF具有无创伤性和易于操作的优点，在大规模人群流行病学调查中或健康筛查中具有明显的优势。近年来蛋白质组学的发展，作为体液的NLF的研究也越来越得到人们的关注。

1 NLF中的组分及其采集方法

NLF中含有丰富的细胞或可溶性成分，由于呼吸道症状的出现与一些可测到的炎性介质及细胞成分有关，接触不同种类的有害因素后，比较NLF中各种生物标志物的变化模式有助于阐明致病机理。

NLF中含有许多炎性或过敏性生物标记物，通过离心可以将细胞成分和可溶性成分进行分离。正常人群NLF中的细胞主要为中性粒细胞，嗜酸性粒细胞和淋巴细胞，一些主要蛋白质为嗜酸性阳离子蛋白（ECP），白细胞趋化因子－8（IL-8），克拉拉细胞蛋白－16 （Clara cell protein 16,CC-16），脂皮质素－1（lipcortin-1）等。在病理和刺激因素作用条件下，正常人群的NLF还可产生一些代谢物和渗出物，如尿酸、尿素等。

翟日洪［2］和Graham［1］所提出的NLF采集方法为：受检者取坐位，头颈后仰45°，抬高腭部并关闭鼻咽部，检查人员用一次性注射器将定量的37℃生理盐水滴入受检者两侧鼻腔，嘱受检者保持颈后仰10 s，然后让其低头使灌洗液流入一消毒过的漏斗，漏斗插入一干净的试管以收集灌洗液，漏斗内壁衬有两层消毒纱布以滤去可能存在的鼻内黏液，将收集有灌洗液的试管迅速置于-20℃保存，24 h内测定灌洗液中各项指标的含量及其活性。

2 NLF的组分检测及其应用研究

鼻灌洗法操作简便、安全，是研究呼吸道病理生理变化的一种有效方法。为探讨氯气损害呼吸道的作用机制，翟日洪等［3］研究了17名造纸工人接触氯气前后鼻灌洗液中尿素、尿酸、白细胞介素-8等炎症标志物的浓度变化，结果表明，吸入氯气后，它们的浓度明显升高。接触氯气4周后，NLF中一氧化氮，丙二醛、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、维生素C的含量及活性监测结果显示，NLF中一氧化氮、谷胱甘肽含量显著升高［2］。刘宏亮等［4］分别用0、1、2、3 mg/m3的甲醛对10名受试者进行眼部控制暴露，结果表明甲醛暴露后NLF中的P物质含量增加，NLF中的P物质可作为评价甲醛急性刺激效应的生物标志物。Pazdrak等［5］在研究甲醛的过敏效应时发现，运用甲醛进行激发试验，在激发前、后不同时相检测NLF中的白蛋白和总蛋白水平，过敏患者NLF中的白蛋白和总蛋白浓度均有增加。Palczynski等［6］对戊二醛的过敏效应研究中也得出相同的结论。为研究挥发性有机物的吸入对NLF中生物标志物的影响并评价鼻灌洗法的可行性，王春等［7］对室内装修油漆工的鼻灌洗液中白细胞介素、ECP等含量进行了检测，结果发现所测的白细胞介素、ECP等炎症性生物标志物含量均高于对照组，吸入挥发性有机物可对呼吸道产生一定的炎症效应，增加鼻炎、哮喘等过敏反应的可能性。

Palczynski等［8］运用鼻激发试验检测患者对氯胺T（Chloramine T）的呼吸道过敏性，结果发现过敏者的NLF中嗜酸性粒细胞数、嗜碱性粒细胞数和白蛋白、类胰蛋白酶、ECP的浓度均显著升高，提示NLF的组分分析能为氯胺T的过敏者提供诊断依据。Krakowiak等［9］对职业性过敏患者的研究中和Bernardini［10］，Jacobi等［11］在哮喘的研究中也有类似的发现。在变应性鼻炎的发病研究中，洪苏玲等［12］采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法测定了30例变应性鼻炎患者及20例健康对照者血清、NLF中ECP和可溶性E2选择素的浓度，结果发现变应性鼻炎组NLF中的ECP含量明显高于对照组。Rami等［13］研究了29例季节性过敏性鼻炎患者、21例长期性过敏性鼻炎患者及20例健康志愿者NLF中嗜酸细胞活化趋化因子和α2巨球蛋白的表达情况，结果发现，与健康志愿者相比，季节性过敏性鼻炎患者和长期性过敏性鼻炎患者NLF中嗜酸细胞活化趋化因子的水平显著增高，发作期季节性过敏性鼻炎患者和长期性过敏性鼻炎患者嗜酸细胞活化趋化因子的水平显著高于非发作期季节性过敏性鼻炎患者；发作期季节性过敏性鼻炎患者NLF中α2巨球蛋白的表达水平显著地高于健康志愿者以及非发作期季节性过敏性鼻炎患者；发作期季节性过敏性鼻炎患者和长期性过敏性鼻炎患者NLF中嗜酸粒细胞的数量与健康志愿者相比显著地增多，发作期季节性过敏性鼻炎患者NLF中嗜酸粒细胞的数量显著高于非发作期季节性过敏性鼻炎患者；嗜酸细胞活化趋化因子、α2巨球蛋白和嗜酸粒细胞的数量，三者紧密相关。Sugimoto等［14］运用高效液相色谱技术检测了47名过敏性鼻炎和12名健康志愿者NLF中4种前列腺素（PGs）（PGD2，PGE2，PGF2α和 6－酮－PGF1α）的含量，结果显示两组间PGD2，PGE2的含量差异有显著性，过敏性鼻炎组组胺的含量显著增高；经过抗组胺药物治疗后，过敏性鼻炎组NLF中的组胺含量有一定程度的下降，但PG含量没有显著下降。

在灌洗液中加入激发物、药物进行刺激试验或疗效鉴定，张宗芬等［15］在鼻部变应原激发试验（NAC）前、后24 h，取9个时相NLF中的ECP、IL25浓度为指标，观察并比较ECP、IL25在过敏性鼻炎（AR）发病的病理、生理过程中的作用。在探讨NLF中细胞间黏附分子－1（ICAM-1）和白细胞介素－6（IL-6）水平及其与气道反应性的关系时，张秋贵等［16］采用ELISA法检测了54例变应性鼻炎患者及20例健康对照者，结果显示在特异性变应原鼻激发试验后1 h NLF中ICAM-1和IL-6的浓度可以反映AR的严重程度而且NLF较传统的鼻黏膜活检更加安全、简便、实用，病人易于接受，不受病情变化影响，适于临床动态观察患者病情的变化。

3 蛋白质组学在NLF中的运用

“蛋白质组”（proteome）最早由澳大利亚学者Wilkins和Willianms于1994 年提出，并由Wasinger等于1995年首次公开发表［17］，是指基因组表达的全部蛋白质及其存在形式。蛋白质组学是基于蛋白质分离技术同时对大量蛋白质表达水平及蛋白质翻译后修饰、蛋白质的结构功能及相互作用等进行研究的学科［18］。在众多的NLF蛋白质中，仅仅通过研究某一种或某几种蛋白质的含量变化来揭示疾病的发生发展显然是不够的，若希望对某种疾病有一个明确而较全面的认识，就需要对NLF的所有蛋白质进行综合评价。

蛋白质组的研究流程大体可分为分离、鉴定、分析三步，首先提取蛋白质，进行双向电泳以分离蛋白质，然后进行蛋白质样品显色，切下待分析的蛋白质斑点，用胰蛋白酶胶内消化，接着对消化后的多肽片段进行生物质谱分析，得到肽质量指纹图谱，最后通过数据库检索对蛋白质进行鉴定及功能分析。

二维聚丙烯酰胺凝胶电泳（2D-PAGE）的发展使得对蛋白质混合物的分离达到可重复性和高分辨率，使得定性和定量分析细胞或组织标本中的蛋白质成为可能。20世纪70年代随着软电离技术ESI（电喷雾电离）和基质辅助的激光解析电离化飞行时间质谱（matrix assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrum，MALDI-TOF-MS）技术的出现，质谱成为现代蛋白质科学中最重要和不可缺少的部分［19］。

Lindahl等［20］就曾对过敏性鼻炎及哮喘患者NLF中的蛋白质进行分离，结果发现，与正常人相比，患者NLF中的CC-16蛋白减少而lipcortin-1升高，并且这两种蛋白质可能对过敏性鼻炎及哮喘的发病发挥一定的作用。Ghafouri等［21］对吸烟者和非吸烟者NLF的蛋白质进行了研究。结果发现，与非吸烟者相比，吸烟者的NLF中克拉拉细胞分泌蛋白减少，脂皮质素-1变异修饰体、3种酸性形式的α1抗胰蛋白酶和1种磷酸化半胱氨酸蛋白酶增多。而且吸烟者的NLF富含较多的腭肺鼻上皮克隆（palate, lung and nasal epithelial clone，PLUNC），一种近来被识别的气道刺激标志物 ［22］。这些结果显示，NLF的双向电泳结果可用于吸烟者NLF中表达蛋白变化的评估。克拉拉细胞分泌蛋白CC16，CC10和脂皮质素-1是两种抗炎及磷脂酶A2抑制蛋白，这些蛋白表达水平的改变对由吸烟引起的气道炎症而言非常重要。

4 展望

鼻灌洗方法易操作、无侵害性，指标客观可靠，具有广阔的应用前景。在NLF的蛋白组学研究中样品前处理过程主要包括三方面内容：① 去除高丰度蛋白质，提高对低丰度蛋白质的检测；② 降低体液样品中的盐浓度，提高等电聚焦效果；③ 尽可能分成多个组分，富集低丰度蛋白质，提高分辨率。在不久的将来, 有望建立一个包括人各种肺病的NLF和BALF的完整二维电泳图谱。而基于上述有效蛋白质组的研究，对于明确各种肺病的发病机制、疾病的诊断及判断疾病的预后等将产生广泛而深远的影响。

5 参考文献

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(收稿日期：2006-02-28)

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