表皮生长因子及其受体在腋(臭)区顶泌汗腺中的表达及临床意义

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[摘要]目的:研究表皮生长因子(EGF)及其受体(EGFR)在腋(臭)区顶泌汗腺细胞中的表达情况及其临床意义。方法:采用免疫组织化学方法(S-P法)检测腋臭患者和正常人腋区顶泌汗腺细胞中EGF 和EGFR的表达水平。利用计算机图像分析技术测量腋臭患者和正常人腋区顶泌汗腺细胞EGF 和EGFR表达的平均光密度。结果:①EGF在腋臭患者顶泌汗腺组织中的表达显著高于正常人(P

[关键词]EGF;EGFR;腋臭;免疫组化

[中图分类号]R758.74[文献标识码]A[文章编号]1008-6455(2010)10-1490-03

Expression of EGF and EGFR in apocrine glands of human axillae in osmidrosis

XIE Qun1,SHAN Sheng-guo2,SUN Wen-tao3,LIU Xuan3

(1.Department of Plastic Surgery,the Central Hospital of Xiangfan,Xiangfan 441021,Hubei,China; 2.Department of Plastic Surgery,the Renmin Hospital,Wuhan University;3.Department of Plastic Surgery,the Fisrt Hospital of Yichang)

Abstract: ObjectiveTo investigate the expression and clinical significance of EGF and EGFR in apocrine glands from human axillae of osmidrosis.MethodsThe immunohistochemical S-P method was used to examine the expression of EGF and EGFR of apocrine glands from osmidrosis patient and health adult. Image analysis system was applied to measure the expression level of EGF and EGFR of apocrine glands from human axillae of osmidrosis and health adult.Results①The expression of EGF in apocrine glands of experimental group were found significantly higher than control group (P

Key words: EGF; EGFR; osmidrosis; immunohistochemistry

腋臭症( axillary osmidrosis ) 是由腋窝顶泌汗腺(大汗腺)产生的分泌物,排出体外后经细菌分解,产生一种难闻的气味,严重者影响患者的社会人际交往。EGF具有多种生物学活性和丰富的临床应用前景。EGF存在于人体的许多组织中,特别是腺体细胞中。EGF与靶细胞膜上的受体结合后,通过直接诱导磷酸化从而介导各种信号转导途径来发挥生物学效应[1]。在复杂的机体物质代谢过程中,推测EGF和EGFR介导的磷酸化过程可能在胆固醇和脂肪酸合成过程中起到调控作用。为了进一步探讨腋臭的发病机制,本研究采用免疫组化和图像分析的方法对EGF和EGFR在腋臭患者腋区顶泌汗腺组织中的表达情况进行了半定量研究。

1材料和方法

1.1 实验对象:实验组:取2007年3月～2007年8月进行手术治疗腋臭的患者40例,其中女性30例,男性10例,中位年龄25.2(16～38)岁。对照组:同期行腋部切口隆乳手术的患者10例,均为女性,中位年龄 28.7(26～34)岁。

1.2 方法:获取试验对象腋区皮肤及皮下汗腺组织,处理、固定标本,制作来源于同一标本不同部位的顶泌汗腺的蜡块、制备切片,石蜡切片常规脱蜡、水化后用PBS冲洗,过氧化物酶阻断剂封闭内源性过氧化物酶活性,加入一抗,室温孵育,加生物素标记的第二抗体,加链霉亲和素的过氧化物酶溶液,孵育后滴加DAB显色,苏木素复染,常规脱水、透明、封压。按照随机化的原则,取其中1个部位的切片相对应的组织块作为免疫组织化学染色的目标对象。

1.3 试剂:浓缩型鼠抗人EGF多克隆抗体、浓缩型鼠抗人EGFR多克隆抗体以及免疫组化试剂盒均购于武汉博士德生物工程有限公司。

1.4 结果判定:在200×光镜下,运用HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文报告管理系统,对EGF和EGFR抗原在腋区顶泌汗腺细胞中的表达进行半定量分析。每张切片随机选取5个完整且不重叠的视野行定量分析,测定每个视野下阳性反应的平均光密度。以每例5个视野的平均光密度的平均值作为该例的测量值。

1.5 统计学分析:测量数据均以均数±标准差(x±s)表示,利用SPSS13.0统计分析软件对EGF和EGFR的实验结果进行t检验,以P

2结果

2.1组织学观察:在光镜下观察腋区顶泌汗腺HE染色的标本可见,通过比较同一标本不同视野下顶泌汗腺细胞后,发现分泌细胞呈现柱状、立方和扁平形态,其胞核的形态及胞浆中嗜酸性分泌囊泡(颗粒)的数量有不同。柱状细胞的顶部可见有大量明显嗜酸性小囊泡聚集,部分细胞顶部的分泌物形成较大的圆球状结构凸向管腔;立方细胞的嗜酸性小囊泡的数量较柱状细胞中的数量明显为少,在细胞的顶部未见有圆球状结构形成;扁平细胞的胞质很少,未见有嗜酸性小囊泡分布或仅见极少量囊泡分布其中。

本实验中,每种类型的顶泌汗腺所占的比例是不一样的。在试验组观察到顶泌汗腺的腺腔呈圆形或略不规则形,以柱状细胞构成的为主,扁平细胞和立方细胞较少,(图1)。而在对照组中以扁平细胞和立方细胞构成的顶泌汗腺相对较多,柱状细胞很少,腺腔呈不规则形(图2)。

2.2 EGF的表达:EGF的阳性定位主要位于顶泌汗腺细胞的胞浆中,表现为细胞胞浆中有棕黄色颗粒沉积。试验组胞浆中可见大量的棕黄色颗粒沉淀,EGF表达较强。健康对照组胞浆中棕黄色颗粒沉淀较少,EGF表达弱或不表达。2组之间的EGF平均光密度差异具有统计学意义P

2.3 EGFR的表达:EGFR的阳性定位主要位于顶泌汗腺细胞的细胞表面,表现为细胞表面棕黄色颗粒分布。试验组细胞表面可见大量的棕黄色颗粒沉淀,EGFR表达较强。对照组细胞表面棕黄色颗粒沉淀较少,EGFR表达弱或不表达。两组之间EGFR的平均光密度差异具有统计学意义P

3讨论

腋臭的确切病因尚不明确,研究发现刚排出皮肤表面的大汗液呈乳白色,没有臭味,排出后不久受到腋窝潮湿部位细菌(表皮葡萄球菌、格兰氏阴性杆菌等) 的分解,才发出典型的令人厌恶的臭味。Zeng等[1]通过气相色谱/质普法检测发现,腋臭的气味系由C6-C11的不饱和支链脂肪酸所致,主要是(E)-3-甲基-2-己烯酸(E-3-methyl-2-hexenoic acid,E-3M2H)分子。James等[2]研究发现类白喉杆菌在腋臭的形成中有调控作用,较其它常见皮肤菌群作用大。

随着研究工作的深入,顶泌汗腺细胞的生理及病理功能方面的研究得到越来越多的重视。顶泌汗腺虽然在出生时就存在,但是直到青春期才表现其分泌功能。顶泌汗腺细胞的分化、增值和结构形成受多种基因和因子的调控,推测顶泌汗腺细胞的功能异常可能与这些调控因子的变化有密切关系。Pesonen等[3]首次报道EGF在腋窝顶泌汗腺液中的存在,证实了顶泌汗腺比外分泌汗腺含有的EGF的量更多(可达50倍) 。EGF存在于人体的许多组织中,特别是腺体细胞中。EGF因其具有多种生物学活性和丰富的临床应用前景,成为近年来生物化学研究的热点之一。Saga等[4]通过比较人类外分泌和顶泌汗腺中EGF的表达方式,证实了EGF分布在汗腺的分泌部,并且顶泌汗腺分泌细胞比外分泌汗腺分泌细胞具有更强的反应性。免疫电镜下显示顶泌汗腺分泌细胞内线粒体样小颗粒中抗EGF抗体呈阳性反应,推测EGF的作用机制是由汗腺中的分泌细胞产生的EGF控制分泌细胞自己的增殖和功能[5];由于导管细胞抗EGF阴性反应,说明导管细胞不能产生EGF,但其EGF受体可以通过接受汗液中EGF的活化,并影响着导管细胞的增殖和功能。EGF在肌上皮细胞中的生理作用知之甚少,Schon M等[6]认为肌上皮细胞在外分泌和顶浆汗腺中不表达EGF受体, 但有报道认为在加入EGF的培养基中肌上皮细胞具有向上皮和间质选择性分化的潜能。

EGF能够发挥作用是于其受体密不可分的。EGFR存在于人体除造血系统外的几乎所有组织中。EGF是与靶细胞膜上EGFR结合后发挥生物学效应的。二者的结合具有高亲和力、时间与温度的依赖性、饱和性和可逆性。研究发现,EGFR与核内染色体相连,可通过直接诱导特殊白的磷酸化而发挥其生理功能。EGF首先与EGFR的胞外结合部位结合,导致受体分子发生二聚化,促使EGFR羧基末端的三个酪氨酸残基(Tyr)自身磷酸化位点发生磷酸化,使受体酪氨酸激酶活化,从而磷酸化受体本身及下游的信号分子,磷酸化的受体通过其磷酸化酪氨酸残基可与蛋白质的SH2结构域相互作用,结合胞内的信号转导分子。已知EGFR的活化可以使细胞内三磷酸肌醇和二酰基甘油增多,结果引起细胞内游离钙离子增多,激活磷酸蛋白激酶C和磷酸蛋白激酶A,从而介导各种信号转导途径,使细胞增殖和功能发生改变。

英国[7]有研究利用离体人类皮肤附属器对胆固醇和脂肪酸生物合成过程中的两种重要催化酶,即3-羟基-3-甲酸戊二酰基辅酶A(HMG-CoA)还原酶和乙酰CoA羧化酶分别进行测定,发现HMG-CoA还原酶和乙酰CoA羧化酶均可以通过磷酸化失活。说明磷酸化和外源性胆固醇可调节人类顶泌汗腺、皮脂腺和毛囊内的HMG-CoA还原酶和乙酰CoA 羧化酶的活性。在复杂的物质代谢过程中,推测EGF和EGFR介导的磷酸化过程可能在胆固醇合成过程中,起到调节作用。

Spielman等[8]研究发现:3M2H是伴随分子量分别为45和26kDa的两种分泌物载体蛋白而分泌到皮肤表面。而这两种蛋白质,也就是所谓的顶浆汗腺分泌物偶联蛋白(ASOB1和ASOB2)。Natsch等[9]研究发现:3M2H在胞浆中同ASOB2分子的N-末端的谷氨酰胺残基,首先以共价键结合在一起的,到达皮肤表面被特异性的棒状杆菌的酶,即Nα-酰基谷氨酰胺氨基酰化酶分解后,以非共价键的形式同ASOB2结合,最终导致了臭味气体缓慢地产生。Natsch等[10]通过鉴定一连串可挥发性脂肪酸,发现形成复合气味的不同的酸都是与Gln以肽键连接在一起的。EGF能够通过提高谷氨酰胺酶和谷氨酰胺合成酶的活性,增加组织中谷氨酰胺的合成、摄取即利用。

综上所述,通过以上研究我们发现:腋臭患者顶泌汗腺组织中EGF和EGFR的表达明显高于正常人,提示EGF和EGFR在腋臭的发生、发展过程中具有一定的意义。我们推测可能是当EGF与EGFR结合后,诱导顶泌汗腺细胞中分泌物合成相关基因的表达能力增强,使细胞明显肥大,促进E-3M2H等挥发性物质合成增多,在以apoD蛋白作为载体的协助下,运送挥发性物质分泌到皮肤表面。后经过寄生于皮肤表面的细菌(棒状杆菌、葡萄球菌)的分解作用,使E-3M2H等挥发性物质被释放出来。然而,迄今为止,对腋臭发病机制的研究刚刚起步,有大量的问题有待今后进一步深入的基础和临床研究。

[参考文献]

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[2]James AG,Casey J, Hyliands D,et al,Fatty acid metabolism by cutaneous bacteria and its role in axillary malodour[J].World J Microbiol Biotechnol,2004,20:787-793.

[3]PesonenK,ViinikkaL,KoskimiesA,et al.Size heterogeneity of epidermal growth factor in human body fluids[J].Life Sci,1987,40:2489-2494.

[4]SagaK,Jimbow K.Immunohistochemical localization of activated EGF receptor in human eccrine and apocrine sweat glands[J]. J Histochem Cytochem,2001,49 (5):597-602.

[5]陈伟,付小兵,孙同柱,等. 表皮细胞生长因子及其受体在胎儿皮肤组织内的表达特征及其意义[J].中国临床康复,2002,6(8):1128-1133.

[6]Schon M,Benwood J,O 'Connell-Willstaedt T,et al. Human sweat gland myoepithelial cells express a unique set of cytokeratins and reveal the potential for alternative epithelial and mesenchymal differentiation states in culture[J]. J Cell Sci,1999,112(Pt12):1925-1936.

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[8]Spielman AI,Zeng XN,Leyden JJ,et al. Proteinaceous precursors of human axillary odor: isolation of two novel odor-binding proteins[J].Experientia,1995,51: 40-47.

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[10]Natsch A,Derrer S,Flachsmann F,et al. A broad diversity of volatile carboxylic acids, released by a bacterial aminoacylase from axilla secretions,as candidate molecules for the determination of human-body odor type[J].Chem Biod, 2006,3(1):1-20.

[收稿日期]2010-06-26 [修回日期]2010-09-25