临床检验中丙型肝炎病毒的常用检测项目及意义
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[摘要] 丙型肝炎病毒（HCV）为嗜肝性慢性病毒。HCV感染后，患者的起病和临床症状极不典型，以亚临床感染为多见，容易造成漏诊。丙肝自然转阴率低，治疗效果差，病程迁延，易早期出现肝硬化、肝癌，死亡率较高，因此HCV的检测对丙型肝炎病毒感染的早期诊断和指导临床治疗有重大的意义。目前用于HCV感染诊断的常用主要指标有抗-HCV、HCV-cAg、HCV-RNA、丙肝基因型。现多采用的第三代检测抗-HCVEIA试剂增加了HCV基因组Ns5区表达的蛋白作为抗原，进一步提高了试剂的敏感性，但还存在“窗口期”长、假阳性等问题。HCV核心抗原出现早，检测敏感性好，特异性高，操作简便、快速，对处于HCV感染“窗口期”的个体检测有很大价值。HCV-RNA检测灵敏度高、特异性强，具有早期诊断的意义，是EILSA技术的有力补充，常常作为HCV感染的主要确诊手段。尤其在慢性丙型肝炎治疗中，HCV-RNA定量检测作为最重要的实验室检测指标。丙型肝炎的基因分型在临床上主要是决定干扰素和利巴韦林的疗程和用量。
[关键词] 丙型肝炎病毒；检测；临床检验；临床意义
[中图分类号] R512.6+3 [文献标识码]A [文章编号]1674-4721（2011）05（c）-０14－０2
丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）是丙型肝炎的病原体，曾被称为肠道外传播的非甲非乙型肝炎病毒。1991年被分类为黄病毒科丙型肝炎病毒属。据美国疾病预防与控制中心（CDC）调查发现，丙型肝炎的发病率约7.1/10万，目前全世界的丙型肝炎病毒（HCV）感染者超过1亿人，其中我国约有4 000万，我国HCV的感染率在0.9％～5.1％。丙型肝炎自然转阴率低，治疗效果差，病程迁延，且与肝硬化、肝癌等的发生及发展显著相关。掌握和了解目前临床常用的检测项目的方法和意义，对丙型肝炎的诊断和治疗具有指导性的重大作用。
1 丙肝抗体（抗-HCV）检测
丙肝抗体（抗-HCV）检测，是目前临床上最常用的检测技术。此种检测采用间接酶联免疫法，将已知抗原吸附于固相载体，加入待检标本（含相应抗体）与之结合，洗涤后，加入酶标抗抗体和底物进行测定，是间接检测病毒感染的一种方法。其采用重组或者合成的HCV多肽作为包被抗原，按包被抗原的不同试剂发展经历了3代：第1代试剂盒的包被抗原来自HCV病毒基因组非结构区C100-3，HCV感染3～4个月后可检测到抗-HCV阳性，敏感性较高，达到80％～90％，但假阳性较高[1-3]。第2代试剂除了包被非结构区C100-3抗原外又加入了HCV病毒基因组核心区多肽C22-3和非结构区抗原C33-c，敏感性和特异性明显提高，感染后8～12周即可检测。第3代试剂中包被抗原又增加了NS5蛋白，其敏感性和特异性得到进一步改善。临床实验室对丙型病毒性肝炎的诊断，都是使用第3代抗-HCV ELISA试剂，其包被抗原多，包括HCV-core、NS3、NS4和NS5抗原，大部分为基因工程生产的抗原，特异性和灵敏度达99％[4]。
ELISA法检测抗-HCV具有重复性强，成本低的优点，世界卫生组织认为这种方法适合用于大量样本检测。目前其不仅普遍应用于临床，也用于献血者筛查。但是抗HCV-ELISA存在以下不足：①假阳性问题，HCV感染率
2 丙肝核心抗原（HCV-cAg）检测
此种检测也采用间接酶联免疫法，利用包被在酶标板固相载体上的单克隆抗体捕获待测样本中的HCV抗原,然后加入与包被抗体识别不同抗原表位的酶标记的不同株单克隆抗体检测。目前已开发出两种HCV核心抗原的ELISA检测试剂：一种是直接检测血清或血浆样品中的游离HCV核心抗原，主要用于血液筛查以缩短窗口期；另一种是检测血清或血浆样品中的总HCV核心抗原。2001年Ortho公司推出了检测HCV 核心抗原（HCV-cAg）ELISA试剂以来，HCV-cAg检测大多以进口试剂为主；国产试剂也在近几年问世，但在临床推广上做得不够。
丙肝核心抗原（HCV-cAg）检测近几年得以迅速发展，临床意义十分重要：丙型肝炎患者在感染丙肝病毒后１~４周内血清HCV-RNA 转阳，同时HCV-cAg 出现，随后ALT 增高和HCV 抗体转阳。HCV-cAg几乎与HCV-RNA同时出现，也是HCV感染的早期标志，比HCV-RNA晚1～2 d，与抗-HCV相比检出时间提早23~46 d[5]。钟锐兴等[6]报道，HCV-cAg阳性与HCV-RNA阳性符合率达90.5%（19/21），说明HCV-cAg和HCV-RNA的动力学变化密切相关，可以作为丙型肝炎复制的标志。
这项检测技术窗口期短，敏感性好，特异性高，操作简便、快速，不需要特殊的仪器，费用低廉，能达到早期诊断的目的。因此笔者认为HCV核心抗原检测可作为HCV抗体检测的补充试验，适合大规模筛查和大多数地区医院的常规检查。但是联合应用于临床，其敏感性和特异性有待提高，目前主要处于临床对比实验和评价阶段。
3 丙肝核酸（HCV-RNA）检测
临床对丙型肝炎病毒的核酸检测包括定性检测和定量检测。定性试验包括RT-PCR和转录介导；定量实验包括巢氏PCR法、竞争性逆转录PCR技术、放射性核素掺入法等。目前临床广泛使用的方法以实时荧光定量PCR为主，其原理是：在常规PCR基础上添加荧光染料或荧光探针，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析[7]。
HCV基因组为单股正链RNA，全长约9.5 kb，包括5′端的结构基因及3′端的非结构基因。具有单一的开放阅读框（ORF），几乎跨越整个基因组，编码3011或3010个氨基酸。实时荧光定量PCR探针的设计，引物大多选在5′-UTR区，因为这个区域保守性是最高的，对HCV-RNA的RT-PCR扩增是最好的。
临床意义：PCR技术是目前分子生物学领域中灵敏度最高，特异性最强的一项检测技术。在丙肝感染初期血清中病毒含量极低时[8]，用常规的分子杂交技术难以检出HCV-RNA，PCR解决了这个难题，可以使检测的窗口期从抗体出现的70 d大大缩短到1~2周[9]，对早期诊断和血液筛查有极大的意义；在血清学检测不明确或血清学指标与临床表现不符时，是EILSA技术的有力补充，常常作为HCV感染的主要确诊手段；尤其在慢性丙型肝炎治疗中，HCV-RNA定量检测作为最重要的实验室检测指标，起到不可替代的作用：①决定患者是否开始治疗，仅HCV-RNA阳性的患者才考虑抗病毒治疗；②在干扰素联合利巴韦林治疗过程中，需根据RNA定量检测结果进行抗病毒治疗监测、疗效判断及治疗方案的调整，即应答指导的治疗策略(response guided therapy，RGT)；③基线的RNA水平及动态变化与疗效相关，急性期RNA水平的快速降低预示着病毒的自然清除，而基线RNA水平越高预示着治疗越困难[10]。
4 丙肝基因分型测定
HCV在复制时，由于多聚酶缺乏校正功能，复制过程中容易出错而导致变异率升高，所以HCV呈高度异质性，即HCV病毒基因有较强的变异性。HCV变异位点可以发生在基因组的各个区域，根据变异位点的不同，有几种基因分型系统。其中Simmonds系统是由Simmonds P等[11]建立的，它针对HCV基因组C区E1区和NS5区的核苷酸序列分析，将HCV分为6个主要的基因型以及70多种亚型，是目前通用的HCV分型命名系统。HCV基因型的金标准是利用RT-PCR扩增HCV基因组种系信息区（Ns5B、核心区或E1）并测序，测序的结果再与已知基因型序列比较。临床上应用基因特异性寡核苷酸探针或限制性片段长度多态性分析对HCV的NS5B和E1区域进行测序来确定HCV基因分型，两种方法均已标准化，能够测定HCV的6个基因型和一系列亚型。
目前，作为临床指导治疗的指标，HCV主要基因型就足够了，所以测序在临床实验室很少开展，而对HCV主要基因型进行分型比较普遍，主要有两种方法：①分子生物学分型技术，其已经商品化试剂和技术有Bayer的TRUGENE 5′NC HCV试剂盒和测序系统以及分析软件、自线性探针反向杂交技术（LiPA）、Invader-HCV检测技术、实时荧光PCR等。分子生物学的试剂盒虽然检测原理各有不同，但扩增的区域主要是5′-UTR区，这是因为5′-UTR区具有高度保守性．可以避免由于引物结合位点序列的突变而导致实验失败。同时也由于5′-UTR区不具有HCV其他区域的高度异质性，扩增5′-UTR区的方法也只能检测HCV主要基因型，在亚型方面的检测结果就差一些。②血清学分型技术，其根据HCV某些区域表达抗原具有与基因型对应的型别差异，合成特异性多肽作为包被抗原，对HCV血清抗体进行分型检测。血清学方法中Chiron公司的RIBA SIA检测NS4和核心区编码的抗原，可用来区分1~3型，Murex公司的Murex HCV利用基因型特异抗体直接检测NS4编码的抗原表位，能区分1~6型。血清学技术污染低、方法简单，适用于大样本量的流行病筛查。
丙型肝炎的基因分型应用在临床上主要是决定干扰素和利巴韦林的疗程和用量。根据AASLD丙型肝炎防治指南，干扰素和利巴韦林的联合治疗仍然是治疗丙型肝炎的最佳标准方案，大量的临床试验表明，当利巴韦林和干扰素联合治疗时，1型患者的治疗效果没有2、3型的效果好。用丙肝标准治疗（PEG-IFN-α加RBV 800 mg/d联合治疗）24周，基因2、3型患者的SVR达70%~80%，相反基因1型患者的SVR仅40%~50%，且需治疗48周。同时丙肝基因分型在流行病学，急性HCV感染转归，病情的严重性，肝脂肪变，IFN-α疗效以及疫苗的研制都具有十分重要的作用。
以上几种方法被普遍应用于临床，互相补充，对丙型肝炎的及早诊断和正确治疗起到非常重要的作用。
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（收稿日期：2011-04-12）