4型PEPC基因油菜叶片特异性表达的可行性探讨'> 转玉米C4型PEPC基因油菜叶片特异性表达的可行性探讨
开篇：润墨网以专业的文秘视角，为您筛选了一篇4型PEPC基因油菜叶片特异性表达的可行性探讨'> 转玉米C4型PEPC基因油菜叶片特异性表达的可行性探讨范文，如需获取更多写作素材，在线客服老师一对一协助。欢迎您的阅读与分享！
摘要：C4型pepc基因导入C3植物可提高C3植物的光合能力，抑制油菜C3型PEPC基因的表达能提高油菜含油量，因此要进一步提高油菜的光合生产力和促进油脂积累，有必要在油菜叶片异性地表达玉米的c4型pepc基因。通过克隆玉米、水稻和油菜的rbcS叶片特异性启动子，构建rbcS调控的玉米C4型PEPC基因叶片特异性表达载体，转化油菜获得叶片特异性高效表达的转PEPC基因植株，与原种和转玉米C4型PEPC基因油菜相比较，研究各株系PEPC酶活性和光合生理表现；根、茎、叶与种子器官玉米C4型PEPC基因的表达差异；分析各株系油菜油脂和蛋白质含量、单株产量等农艺性状。通过在油菜叶片异性地表达玉米的C4型PEPC基因，提高油菜单叶的光合速率，促进油菜油脂积累，为油菜的高产育种提供新途径。
关键词：油菜；PEPC基因；rbcS启动子；光合速率
中图分类号：S634.3；Q786 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）22-5396-03
1 玉米C4型PEPC基因导入油菜的意义
油菜（Rape or Rapeseed or Canola）是以菜子榨油为种植目的的一年生或越年生草本植物，已成为四大油料作物（大豆、油菜、向日葵和花生）之一。与世界上油菜单产水平高的国家相比，中国的差距还很大，但这也说明中国油菜生产在栽培和育种技术方面还大有潜力可挖。在适宜的环境条件下，田间的光能利用率可达5%，而现有光能利用率只有1.11%左右[1]，可见改善光合效率的潜力还很大。但分析现有品种的增产潜力，在叶面积指数达到9以上时，扩大叶面积指数，会引起群体内光能分布的恶化，因此在适宜的光合面积上提高单叶的光合速率，是进一步增加油菜生产能力的一条有效途径。
提高植物的光合效率可能有多种途径，其中将C4光合基因PEPC导入C3植物以提高C3植物的C4光合特性，取得了显著的成绩，Ku等[2]通过农杆菌介导系统， 首次成功地将玉米C4光合途径的关键酶PEPC的基因导入C3植物水稻中，获得了高表达的转基因植株。已有的研究表明转PEPC基因水稻在高光照下表现出高光合能力[2-7]和耐光氧化的特性[8]。陈绪清等[9]利用基因枪转化法，获得了转玉米PEPC基因的小麦植株。大量试验表明，通过分子生物学方法可在C3植物中高水平表达C4高光效基因，C4型PEPC基因在C3植物中参与代谢，对C3植物的生理产生影响。可见通过导入C4光合基因以改良C3植物光合性能，可能是在现有株型和杂种优势利用的基础上进一步提高C3植物的光能利用率，实现作物高光效育种的有效途径。本研究已成功地将来自玉米的PEPC基因导入油研9号和Westar，并获得高表达植株，通过T1代植株相关指标测定，净光合速率可提高15%左右。
2 玉米C4型PEPC基因在油菜叶片上的特异性表达——促进光合作用与油脂合成
油菜种子蛋白质含量与油脂含量呈高度的负相关[10]，丙酮酸羧化酶是将丙酮酸进入蛋白质合成循环的关键酶，陈锦清等[11]利用反义技术抑制油菜PEPC基因表达，结果使油菜含油量显著提高，张银波等[12]利用RNAi技术抑制油菜PEPase基因的表达，使代谢流偏向油脂合成，从而提高油菜子粒中的油脂含量，汪承刚等[13]、张勇等[14]抑制种子PEPC表达，以期提高油菜种子的含油量。可见玉米C4型PEPC基因的导入可使油菜的光合生产力增加，但组成型启动子使外源PEPC基因在转基因植株中不同组织都表达，不利于油菜在种子中油脂的积累。植物叶片是主要的光合器官，在能量的固定和利用中起着十分重要的作用，而PEPC是C4光合途径中的关键酶之一，在叶片中最初固定CO2的酶，因此在叶片异性地表达玉米C4型PEPC基因，既有利于提高油菜叶片的光合能力，又有利于在油菜种子中合成油脂。
3 构建玉米C4型PEPC基因叶片特异性的表达载体
许多叶片特异表达的基因产物都参与光合过程，叶片特异表达启动子对相应基因表达的调控机理具有重要的理论意义和应用价值。关于叶片特异表达启动子rbcS（The small subunits of ribulose 1， 5-bisphosphate carboxylase/oxygenase）、Cab（Chlorophyll a/b binding protein）、PNZIP（Pharbitis nilleu zipper）等的研究较多，也证实了可驱动外源基因在叶片特异表达的功能。①rbcS基因启动子能介导目的基因在植物绿色组织特异性表达，在基因工程中的应用前景广阔[15]，刘巧泉等[16]证实水稻rbcS启动子可驱动GUS报告基因在转基因水稻植株叶片和叶鞘内的叶肉细胞异性高效表达；王友如[17]从浮萍基因组中克隆了一个新的rbcS基因启动子，并对该启动子做了序列分析。刘德兵等[18]以巴西香蕉为材料，克隆分析了rbcS基因启动子。②PNZIP含有一个能与DNA结合的亮氨酸拉链结构域和一个核定位信号肽，Zheng等[19]从典型短日照植物裂叶牵牛中克隆了编码转录因子PNZIP的基因，而后杨予涛等[20]从短日照植物裂叶牵牛中克隆了PNZIP基因启动子，证明了在叶片组织中长度为1 415 bp的PNZIP启动子活性比355 bp的启动子高9倍。肖守华等[21]证明PNZIP启动子能驱动小麦抗真菌γ-2硫堇蛋白（γ2Thionin）基因在甜瓜叶片组织中表达。③植物捕光叶绿素a/b蛋白复合体（Chlorophyll a/b binding protein，Cab）基因是一类典型的光诱导型基因，植物中的Cab启动子具有光诱导和组织特异表达的特性[22]，Simpson等[23]证明梨Cab基因上游400 bp的启动子序列能驱动GUS基因在转基因烟草叶片中的特异表达，王旭静等[24]分离了金华中棉（Gossypiun arboreum var. Jinhua）光诱导基因Cab 5′上游的调控序列1 009 bp，证明获得的这一DN段具有驱动光诱导表达的功能，比CaMV35S启动子高0.6倍。可见通过克隆多种类型的叶片特异性启动子，构建玉米C4型PEPC基因叶片特异性表达载体，在油菜叶片中实现高表达，在种子器官中弱表达或不表达，增大“源”的供应，同化更多能量，有利于油菜在种子中合成更多的油脂，培育含油量高的新品系。
4 结语
转PEPC基因水稻植株不仅使PEPC活性提高20倍，而且其光合速率和羧化效率也分别比原种提高55%和50%，产量提高14%～22%[25]，并表现出一定的抗氧化等生理特性[26]，这说明PEPC基因导入C3植物可以提高C3植物的光合生产力，增强C3植物的抗逆性。凌启鸿等[27]指出，开花期是油菜生长量旺盛的阶段，花后干物质净增量与产量呈极显著正相关，花后油菜光合能力对干物质积累和产量影响明显，因此C4型PEPC基因导入油菜后能提高油菜的光合生产力，增强抗逆性。本研究已获得转玉米C4-PEPC基因的油菜植株，其PEPC酶的活性较原种有显著的提升（约17倍左右），净光合速率提高了15%左右，表明玉米C4-PEPC基因在油菜中成功表达。
综上所述，将玉米C4型PEPC导入油菜中，并在叶片中实现特异性表达，获得高表达的植株，提高油菜单叶的光合速率，促进干物质的积累，增加油菜种子油脂含量，可为培育含油量高、抗逆性强的油菜新品系提供新的技术途径。
参考文献：
[1] 许大全. 光合作用研究进展：从分子机理到绿色革命[J].植物生理学报，2001，27（2）：97-108.
[2] KU M S B， AGARIE S， NOMURA M， et al. High-level expression of maize phosphoenolpyruvate carboxylase in transgenic rice plant[J]. Nat Biotechnol，1999，17：76-80.
[3] ZHANG F， CHI W， JIN C Z， et al. Molecular cloning of phosphoenolpyruvate carboxylase gene from sorghum involved in C4 photosynthesis and breeding transgenic rice[J]. Chinese Science Bulletin，2003，48（14）：1542-1546.
[4] 张桂芳，赵 明，丁在松，等.稗草磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPCase）基因的克隆与分析[J].作物学报，2005，31（10）：1365-1369.
[5] 丁在松，赵 明，荆玉祥，等.玉米ppc基因过表达对转基因水稻光合速率的影响[J].作物学报，2007，33（5）：717-722.
[6] 袁定阳，段美娟，谭炎宁，等.共转化法获得无筛选标记的转PEPC、PPDK基因水稻恢复系纯合体[J]. 杂交水稻，2007，22（2）：57-63.
[7] BANDYOPADHYAY A， DATTA K， ZHANG J， et al. Enhanced photosynthesis rate in genetically engineered indica rice expressing pepc gene cloned from maize[J]. Plant Science，2007，172（6）：1204-1209.
[8] JIAO D M， LI X， JI B H. Photoprotective effects of high level expression of C4 phosphoenolpyruvate carboxylase in transgenic rice during photoinhibition[J]. Photosynthetica，2005， 43（4）：501-508.
[9] 陈绪清，张晓东，梁荣奇，等.玉米C4型pepc基因的分子克隆及其在小麦的转基因研究[J].科学通报，2004，49（19）：1976-1982.
[10] SUGIMOTO T， TANAKA K， MONMA M， et al. Phosphoenolpyruvate carboxylase level in soybean seed highly correlates to its contents of protein and lipid[J]. Agri Bio Chem，1989，53（3）：885-887.
[11] 陈锦清，黄锐之，郎春秀，等.油菜PEP基因的克隆及PEP反义基因的构建[J].浙江大学学报（农业与生命科学版），1999， 25（4）：365-367.
[12] 张银波，江木兰，胡小加.油菜PEPase基因的克隆及其对应RNAi载体的构建[J]. 中国油料作物学报，2005，27（1）：1-4.
[13] 汪承刚，谢 好，李长春，等.甘蓝型油菜三种种子储藏蛋白和丙酮酸羧化酶基因片段的克隆及hpRNA表达载体的构建[J]. 中国油料作物学报，2006，28（3）：245-250.
[14] 张 勇，付绍红，张汝全，等.甘蓝型油菜PEPC基因保守序列的克隆和种子特异性ihpRNA表达载体的构建[J].分子植物育种，2008，6（4）：775-780.
[15] OUTCHKOUROV N S， PETERS J， JONG J DE， et al. The promoter-terminator of chrysanthemum rbcS1 directs very high expression levels in plants[J]. Planta，2003，216（6）：1003-1012.
[16] 刘巧泉，于恒秀，张文娟，等.水稻rbcS启动子控制的外源基因在转基因水稻中的特异性表达[J].植物生理与分子生物学学报，2005，31（3）：247-253.
[17] 王友如.浮萍中一个新rbcS基因启动子的克隆及分析[J].分子植物育种，2010，8（1）：41-44.
[18] 刘德兵，魏军亚，李 飞，等.香蕉rbcS基因启动子的克隆及序列分析[J]. 西北植物学报， 2010，30（2）：237-242.
[19] ZHENG C C， PORAT R， LU P， et al. PNZIP is a novel mesophyll-specific cDNA that is regulated by phytochrome and a circadian rhythm and encodes a protein with a leucine zipper motif[J]. Plant Physiol，1998，116（1）：27-35.
[20] 杨予涛，杨国栋，刘石娟，等.一个光合组织特异表达强启动子的分离及功能分析[J].中国科学（C辑），2003，33（4）：298-306.
[21] 肖守华，乔卫华，张岳民，等. 农杆菌介导法将小麦γ-硫堇蛋白基因转入厚皮甜瓜[J].中国蔬菜，2008（12）：11-14.
[22] GOTOR C， ROMERO L C， INOUYE K， et al. Analysis of three tissue-specific elements from the wheat Cab-1 enhancer[J]. The Plant Journal，1993，3（4）：509-518.
[23] SIMPSON J， TIMKO M P， CASHMORE A R， et al. Light-inducible and tissue-specific expression of a chimaeric gene under control of the 5′-flanking sequence of a pea chlorophyll a/b binding protein gene[J]. EMBO J，1985，4（11）：2723-2729.
[24] 王旭静，李为民，唐巧玲， 等.中棉（Gossypium arboreum）光诱导基因Gacab启动子在转基因烟草中的功能缺失分析[J]. 作物学报，2009，35（6）：1006-1012.
[25] JIAO D M， HUANG X Q， LI X， et al. Photosynthetic characteristics and tolerance to photo-oxidation of transgenic rice expressing C4 photosynthesis enzymes[J].Photosynth Res，2002， 72（1）：85-93.
[26] ZHANG B J， LING L L， WANG R F， et al. Photosynthetic characteristics and effect of ATP in transgenic rice with phosphoenolpyruvate carboxylase and pyruvate orthosphophate dikinase genes[J]. Photosynthetica，2009，47（1）：133-136.
[27] 凌启鸿，冷锁虎，俞春涛.油菜高产群体质量指标及其调控技术的研究与应用研究报告[J]. 江苏作物通讯，1999（专辑）：6-25.