2种聚合方法制备人参皂苷Rg1分子印迹聚合物分离材料的比较研究

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[摘要]为了从中药粗提物中定向分离人参皂苷Rg1及其结构类似物，获得高选择性、高富集率、高吸附性能的人参皂苷Rg1印迹聚合物分离材料，该研究分别采用沉淀聚合法和表面印迹法制备了分子印迹聚合物，并对其吸附性能做了对比研究，研究表明采用上述2种方法制备的人参皂苷Rg1的分子印迹聚合物对模板分子都具有较高的吸附性，其最大表观吸附量可分别达到27.74，46.80 mg・g-1；表面印迹法制备的聚合物的吸附性要明显高于沉淀聚合法制备的聚合物。试验结果表明，对于极性较强的人参皂苷Rg1，采用表面印迹法所制备的分子印迹聚合物具有更高的选择性和更好的吸附性能，为其他极性强的活性分子制备吸附性能良好的印迹聚合物提供了重要参考。

[关键词]分子印迹技术；沉淀聚合法；表面印迹法；人参皂苷Rg1

[收稿日期]2013-04-15

[基金项目]国家自然科学基金面上项目（81173657，81260690，20962012）；江西省科技支撑计划项目（20111BBG70004-2）；江西省教育厅科学技术研究重点项目（GJJ13618，GJJ12518）

[通信作者]尹小英，教授，主要从事药物分析研究，Tel：（010）68933254，E-mail：

[作者简介]刘庆山，硕士生导师，主要从事药理学与民族创新药物研究，Tel：（010）68933254，E-mail：人参皂苷Rg1主要存在于人参、三七等中药材中，具有调节免疫、神经保护、心脑血管保护、促神经干细胞增殖等活性[1-3]。从上述大宗药材中提取，若采用常规分离技术，如柱色谱等，则操作复杂周期长，消耗大量化学试剂，造成环境污染，需要进一步研究成本更低、环境更友好的分离提取技术。分子印迹聚合物（molecularly imprinted polymers， MIP）对目标分子具有特异的选择吸附性，其理论基础是诺贝尔奖获得者Pauling提出的利用抗原铸造抗体的空间结合位点理论[4-5]。制备分子印迹聚合物的常用方法有沉淀聚合法、本体聚合法、悬浮聚合法、溶胀聚合法和表面印迹法等，其中沉淀聚合法是提出较早的一种聚合方法，由于其操作简单而应用较广泛，而表面印迹法则更多地应用于生物大分子印迹聚合物的制备。国内文献对人参皂苷rg1作为模板制备MIP鲜有研究，可能是由于Rg1相对分子质量较大，极性较大，选择的致孔剂极性亦较大，易影响聚合物制备过程中模板分子与功能单体之间氢键的形成，从而导致MIP制备难度较大。本研究探索人参皂苷Rg1 MIP的适宜制备方法，也为相对分子质量较大、极性较强的活性分子MIP的制备提供重要实验依据，具有一定的推广价值。

1材料

UV-2550型紫外-可见分光光度计（日本岛津公司）；Agilent 1200型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；Quanta 200F扫描电镜（美国FEI公司）；HJ-5型多功能搅拌器（常州国华电器有限公司）；KQ-500B型超声波清洗器（昆山市超声仪器系统有限公司）；HH-2型数显恒温水浴锅（国华电器有限公司）；ZYQ-211型恒温振荡器（黑龙江东拓仪器制造有限公司）。

人参皂苷Rg1（纯度98%，20111221）购自江苏泽朗医药科技有限公司；α-甲基丙烯酸（MAA，分析纯）购自国药集团化学试剂有限公司；乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA，分析纯）购于日本东京化成工业株式会社（TCI）；偶氮二异丁腈（AIBN，化学纯）购自上海试四赫维生化有限公司；3-氨丙基三乙氧基硅烷（ATPS， 纯度97%）和溴化钾（化学纯）购自上海阿拉丁试剂有限公司；硅胶（200～300目）购于青岛海洋化工有限公司。乙腈为色谱纯，甲醇、冰醋酸、甲苯及其他试剂均为分析纯，均购自上海星可生化有限公司。

2方法与结果

2.1人参皂苷Rg1的MIP的制备[6-10]

2.1.1沉淀聚合法人参皂苷Rg1，功能单体MAA，交联剂EDMA以1∶5∶5的摩尔比例加入盛有丙酮150 mL的圆底烧瓶中，加热超声溶解；加入引发剂AIBN 10 mg溶解后，60 ℃水浴通氮气15 min，密封，60 ℃水浴聚合24 h；反应合成的聚合物经干燥后，用甲醇-冰醋酸（9∶1）以索氏提取的方式进行洗脱，洗去模板分子以及未聚合的功能单体和交联剂，直至紫外检测无以上物质的紫外吸收；再用甲醇洗去残留的冰醋酸，即得到人参皂苷Rg1的分子印迹聚合物，经60 ℃真空干燥后，备用。空白印迹聚合物（non-imprinted polymers， NIP）的合成除了不加入模板分子人参皂苷Rg1外，其余步骤等同于MIP的制备。

2.1.2表面印迹法将硅胶20 g于6 mol・L-1的盐酸溶液200 mL中，室温下磁力搅拌12 h，静置过夜；抽滤后纯水洗至中性，110 ℃干燥8 h，即得到活化的硅胶。称取20 g活化硅胶于250 mL三口烧瓶中，加入甲苯250 mL，ATPS 50 mL，100 ℃磁力搅拌24 h；抽滤后依次用甲苯、丙酮、甲醇洗3次，洗去残留的ATPS，100 ℃干燥5 h，得到氨化的硅胶。称取氨化硅胶12 g于500 mL三口烧瓶中，加入二氯甲烷200 mL，室温下磁力搅拌10 min，加入MAA 20 mL，在氮气保护下磁力搅拌24 h；抽滤后依次用甲苯、乙醚、丙酮、甲醇洗3次，80 ℃干燥5 h，得到功能单体化的硅胶。称取Rg1 1.5 mmol溶于乙醇15 mL中，加入到盛有乙腈170 mL的三口烧瓶中，然后依次加入MAA 7.5 mol，EDMA 12 mol，AIBN 40 mg和功能化硅胶5.25 g，在氮气保护下60 ℃磁力搅拌24 h。反应合成的聚合物经干燥后，用甲醇-冰醋酸（9∶1）以索氏提取的方式进行洗脱，洗去模板分子以及未聚合的功能单体和交联剂，直至紫外检测无以上物质的紫外吸收；再用甲醇洗去残留的冰醋酸，即得到人参皂苷Rg1的MIP，经60 ℃真空干燥后，备用。NIP的合成除了不加入模板分子人参皂苷Rg1外，其余步骤等同于MIP的制备。

2.2静态吸附试验

将上述试验合成的2种人参皂苷Rg1 MIP和NIP依次精密称取30.0 mg各6份，分别置于10 mL量瓶中，分别依次加入不同质量浓度（10～40 mg・L-1） 的人参皂苷Rg1-乙腈溶液和（0.25～1.5 mg）的金丝桃苷混合溶液3 mL，密闭，于恒温震荡器上震荡吸附12 h，静置，吸取上清液，用HPLC检测溶液中模板分子人参皂苷Rg1和金丝桃苷的浓度变化。由于人参皂苷Rg1 MIP对金丝桃苷无吸附，故仅根据吸附前后溶液中模板分子人参皂苷Rg1的浓度变化计算分子印迹聚合物的吸附量，并进行Scatchard分析。结果见图1，2。

A. 沉淀聚合法；B. 表面印迹法；a.MIP；b.NIP（图2同）。

图1不同方法制备MIP和NIP的等温吸附曲线

Fig.1Binding isotherm curve of ginsenoside Rg1 MIP and NIP by different methods polymerization

等温吸附曲线由MIP（或NIP）的吸附量对人参皂苷Rg1-乙腈-水溶液的平衡浓度作图而得。MIP（或NIP）对模板分子的吸附量（Q）可以用以下公式[7]计算：Q=（C0-CS）V/m。Q为静态平衡吸附量（mg・g-1）；C0为底物的起始质量浓度（mg・L-1）；Cs为吸附平衡时底物的质量浓度（mg・L-1）；V为底物溶液的体积（L）；m为MIPs的使用量（g）。

从图1可以看出，用2种方法制备的人参皂苷Rg1等温吸附曲线中，曲线a均显著大于b，表明MIP的吸附性能明显高于其相应的NIP；当横坐标中人参皂苷Rg1浓度相等时，MIP的吸附曲线

图2不同方法制备的人参皂苷Rg1 MIP的Scatchard图

Fig.2Scatchard curve of ginsenoside Rg1 MIP by different methods

a的Q值明显高于MIP的吸附曲线a中相应位置的Q值，这表明表面印迹法制备的MIP比沉淀聚合法制备的MIP吸附能力要强。

为了更加直观精确的评价2种方法制备的MIP的吸附性能，对人参皂苷Rg1 MIP与目标分子的结合量采用Scatchard方程进行分析，所用方程[7]为Q/C=（Qmax-Q）/Kd。其中，Qmax为聚合物对目标分子吸附的最大表观结合位点数（mg・g-1）；C为目标分子的平衡质量浓度（mg・L-1）；Kd为聚合物-目标分子复合物的解离常数（g・L-1）。根据实验数据，可以计算出MIP的Scatchard方程，分别为Q/C=-3.497Q+97.168（沉淀聚合法），Q/C=-0.985 6Q+0.012（表面印迹法），Q/C=-0.106 1Q+4.965 2（表面印迹法）。

图2为2种方法制备的MIP的Scatchard曲线图，从图2（A）可以看出MIPs的Scatchard曲线呈较好的线性，说明在MIP内形成了1个特异性结合位点；而图2（B）中有2条线性较好的曲线，说明MIP的内部形成了2个对目标分子有特异性结合的位点。

根据Scatchard曲线的斜率（-1/Kd）和截距（Qmax/ Kd），可以计算出沉淀聚合法制备的MIP的Kd=0.286 g・L-1，Qmax=27.74 mg・g-1；表面印迹法制备的MIP的Kd=9.43 g・L-1，Qmax =46.80 mg・g-1和Kd=1.01 g・L-1，Qmax=0.012 mg・g-1。因此可以看出表面印迹法制备的MIP对目标分子Rg1的吸附能力远远高于沉淀聚合法制备的MIP。利用表面电镜技术对该方法获得的材料扫描，发现其形貌成规则球形，粒径在5 μm左右，呈单分散分布，符合分离材料的要求，见图3。

图3人参皂苷Rg1 MIP的电镜扫描图（×6 000）

Fig.3SEM of ginsenoside Rg1 molecularly imprinted polymers（×6 000）

2.3动力学结合试验

为研究2种不同聚合法制备的人参皂苷Rg1 MIP与目标成分的结合动力学性质，精密称取聚合物50 mg，与30 μmol・L-1的人参皂苷Rg1的乙腈溶液5 mL混合，在不同的时间分别测定人参皂苷Rg1在聚合物上的结合量。

为研究上述2种MIP的结合动力学性质，测定了50.0 mg表面印迹人参皂苷Rg1 MIP和沉淀聚合人参皂苷Rg1 MIP在各个不同时间对模板分子的吸附量，见图4，表面印迹人参皂苷Rg1 MIP 在前30 min 的吸附速率很快，吸附量已经占到总吸附量的50%，在120 min 左右吸附可以趋于饱和，达到吸附平衡；沉淀聚合人参皂苷Rg1 MIP对目标成分的吸附速率要稍慢些，整个吸附过程对目标成分的吸附量要明显低于表面印迹MIP，该聚合物在260 min左右仍未达到平衡。由于表面印迹MIP的结合空穴在微球颗粒的表面，目标成分与其结合的传质阻力小，传质速率快；而沉淀聚合法制备的MIP的结合位点分布在整个微球颗粒内部和表面，目标成分与颗粒内部位点的结合空间阻力较大，故传质速率慢，因而相比之下，后者表观的总吸附速率也要慢且吸附量要小。

图4表面印迹人参皂苷Rg1 MIP和沉淀聚合人参皂苷Rg1 MIP的动力学结合曲线

Fig.4Curves of binding dynamics of ginsenoside Rg1 MIP by surface imprinted polymerization and ginsenoside Rg1 MIP by precipitation polymerization

3讨论与结论

本实验以人参皂苷Rg1为模板，分别采用沉淀聚合法和表面印迹法制备了人参皂苷Rg1的分子印迹聚合物，并对这2种聚合物进行了静态吸附试验，结果表明采用2种方法都能够合成对模板分子人参皂苷Rg1有吸附性的分子印迹聚合物，但采用表面印迹法制备的聚合物对模板分子人参皂苷Rg1的选择吸附性要明显高于沉淀聚合法制备的聚合物。沉淀聚合法制备MIP是将模板分子、功能单体、交联剂和引发剂按一定配比溶解在致孔剂中，在适当条件下引发聚合得到了粒径大小均匀、球状的高分子聚合物。表面分子印迹法制备MIP是通过在活化后基体表面引发聚合反应而获得的表面印迹聚合物。2种制备方法所得MIP在性能上存在着很大差异，采用前者制备的MIP通常印迹位点分布不均一，其中一部分处于粒子表面孔壁上，模板分子与其传质速率快；而另一些位点包埋在聚合物颗粒内部，则模板分子与其接近受到较大位阻，传质速率慢。当模板分子较大时，所占据的空间较大，故印迹后表层的位点个数减少，同时由于大分子直径大通过聚合物网状结构到达内部结合位点位阻远高于小分子，故印迹位点的利用率大大降低，影响吸附性能。而表面分子印迹聚合物几乎把所有结合位点局限在具有良好可接近的表面，从而有利于模板分子的被吸附和洗脱，因此该法特别适合大分子的印迹。再者，由于模板分子人参皂苷Rg1是极性分子，采用沉淀聚合法制备过程中因致孔剂大的极性严重影响模板分子与功能单体之间的氢键作用力，导致结合位点分子间作用力减弱，后续得到的印迹聚合物的吸附性能减弱。故对与人参皂苷Rg1印迹来说，采用沉淀聚合法易产生结合位点少且结合位点氢键作用力减弱双重不利因素影响，导致MIP吸附性能远低于后者方法所得MIP。

综上所述，对于极性较强大分子人参皂苷Rg1的印迹来说，采用表面印迹法能够制备具有更好吸附性能和选择性的聚合物，而对于小分子弱极性的分子进行印迹时则选择沉淀聚合法操作更简单，吸附性能更优。

本研究采用表面分子印迹法制备得到高吸附性能人参皂苷Rg1 MIP，将其运用于人参皂苷Rg1及结构类似活性成分的分离，可以大大提高提取效率，减少化学溶剂的消耗，降低制备成本，利于环境保护。该印迹材料具有良好的球形外形和适宜的粒径，将在靶向色谱柱制备方面有很好的应用前景。同时，本研究为其他强极性活性分子的分子印迹聚合物的制备提供了实验依据和方法参考，具有重要意义。

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