活骨胶囊的微生物限度检查方法验证
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摘 要:目的:通过验证试验寻求活骨胶囊的微生物限度检查方法。方法:采用2005年版中国药典规定方法。结果:活骨胶囊可采用常规的平皿法进行微生物限度检查。结论:本法不会对活骨胶囊可能存在的各类微生物产生抑制作用,可用平皿法进行活骨胶囊的微生物限度检查。
关键词:活骨胶囊;微生物限度;平皿法;验证
中图分类号:R284.1 文献标识码:A 文章编号:1673-7717(2010)04-0840-02
Living Bone Capsule Microbial Limit Method Validation
YU Jianchun,LUO Xianghua
(Pok Oi Hospital, Taizhou City, Taizhou 318050,Zhejiang,China)
Abstract:Objective:validation tests to find the limits of micro-organisms living bone capsule inspection methods.Methods:The 2005 edition of Chinese Pharmacopoeia method. Results: Living bone capsule method can be used conventional plate microbial limit tests.Conclusion:This method does not exist in the living bone capsule can produce various types of micro-organisms inhibition can be used plate method bone capsule of living microbial limit.
Key words:bone capsule;living microbial limit;plate method;validation
收稿日期:2009-11-07
基金项目:浙江省食品药品监督管理局资助项目(Z20050262)
作者简介:禹建春(1969-),男,河南泌阳人,主管中药师,主要从事中药制剂的研发与生产。
活骨胶囊是台州市股骨头坏死研究所、台州市博爱医院制剂室共同研制的中药制剂,具有活血化瘀,瘀祛新生,祛风止痛,强筋健骨的作用,用于股骨头坏死与瘀血症。按照2005年版药典要求,当建立药品的微生物限度检查方法时,应对细菌、霉菌及酵母菌计数方法和控制菌检查方法进行验证,以确认所采用的方法适用于该药品。为了保证试验结果的重现性,笔者随机抽取了3批活骨胶囊,用相应试验菌进行了3次独立的平行试验[1],结果显示不会对活骨胶囊可能存在的各类微生物产生抑制作用,可用常规平皿法进行活骨胶囊的微生物限度检查。
1试验材料
1.1活骨胶囊
由台州市博爱医院制剂室提供。
1.2试验用菌种
大肠埃希菌CMCC(B)44102;金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003;绿脓假单孢菌CMCC(B)10104;枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501;白色念珠菌CMCC(F)98001;黑曲酶CMCC(B)98003。以上菌种均有浙江省药品检验所提供,采用中国药典2005年版提供的方法制备菌液。
1.3培养基
营养肉汤培养基;营养琼脂培养基;玫瑰红钠琼脂培养基;胆盐乳糖培养基;胆盐乳糖发酵培养基;曙红亚甲蓝琼脂培养基;溴化十六烷基三甲胺琼脂培养基;甘露醇氯化钠琼脂培养基;改良马丁培养基;改良马丁琼脂培养基。以上培养基由中国生物制品检定所提供。
1.4器具
培养皿;移液管;研钵;试管;三角瓶等。
2试验方法
2.1试液配制
2.1.1 稀释液配制按照药典规定方法[1]配制pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓释液、0.9%无菌氯化钠溶液,备用。
2.1.2验证菌液制备 按药典规定方法[1]制备50~100cfu•mL-1的金黄色葡萄球菌菌悬液、大肠埃希菌菌悬液、铜绿假单胞菌菌悬液、枯草芽孢杆菌菌悬液、白色念珠菌菌悬液、黑曲霉孢子悬液。
2.2平皿菌落计数方法验证试验
2.2.1供试液
称取活骨胶囊10.0g,倒至装有90mL pH7.0无菌氯化钠―蛋白胨缓释液的三角瓶中,于45℃水浴10min,充分摇匀即为供试液。
2.2.2实验组
取上述供试液1.0mL注入平皿中,加入1.0mL含(50~100cfu)试验菌,应避免接触到供试液,立即倾入对应的于45℃水浴保温的琼脂培养基,并摇匀,置规定的温度下培养。
2.2.3菌液组
取试验菌液1.0mL(50~100cfu.),测定其菌数。
2.2.4供试品对照组
取供试液1.0mL,测定其本底菌数。
2.2.5稀释剂对照组
取pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓释液1.0mL,替代供试品,按2.2.2方法测定菌数。
2.2.6回收率计算
实验组的菌回收率(%)=
试验组平均菌落数―供试品对照组平均菌落数菌液组的平均菌落×100%
稀释剂对照组的菌回收率(%)=
稀释剂对照组的平均菌落数菌液组的平均菌落数×100%
2.2.7判定标准实验组和稀释剂对照组的菌回收率均应不低于70%[1]。
2.2.8试验结果 实验组和稀释剂对照组的菌落回收率均大于70%,见表1。
表1试验组和稀释剂对照组的菌落回收率结果
菌种名称供试品批号试验组菌稀释剂对照组菌回收率(%)
大肠埃希菌06100493.299.4
CMCC(B)4410206100594.1101.2
06100694.398.8
06100490.9100.0
金黄色葡萄球菌06100588.899.4
CMCC(B)2600306100695.3100.0
06100492.599.4
枯草芽孢杆菌06100590.699.4
CMCC(B)6350106100688.7101.1
06100486.5100.6
铜绿假单胞菌06100588.8100.0
CMCC(B)1010406100691.498.8
06100491.5100.8
白色念珠菌06100595.7100.6
CMCC(B)9800106100695.3100.0
06100495.7100.6
黑曲霉CMCC06100594.8100.6
(F)9800306100697.0100.6
2.3控制菌检查方法验证
对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠菌群等控制菌检查方法,按2005年版中国药典规定方法逐一进行验证。
2.3.1供试液 按2.2.1方法制备。
2.3.2阴性对照菌的选择[1] 验证大肠埃希菌、大肠菌群检查法时阴性对照菌采用金黄色葡萄球菌;验证金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌检查法时阴性对照菌采用大肠埃希菌。
2.3.3试验组 取供试液10.0mL于适宜的培养基中,再分别加入1mL(10～100cfu)试验菌,按2005版药典项下规定方法操作。
表2各批号菌控情况
控制菌供试品批号供试品试验组阴性对照组
061004+-
大肠埃希菌061005+-
061006+-
061004+-
金黄色葡萄球菌061005+-
061006+-
061004+-
铜绿假单胞菌061005+-
061006+-
061004+-
大肠菌群061005+-
01006+-
2.3.4阴性对照组 分别取供试液10.0mL于适宜的培
养基中,再分别加入1mL(10～100cfu)阴性对照菌,按2005版药典项下所对应控制菌规定方法操作。
2.3.5判定标准[1] 试验组应检出试验菌,阴性对照组不得检出阴性对照菌。
2.3.6试验结果 试验组均能检出试验菌,而阴性对照组未检出阴性对照菌见表2。
3 讨 论
(1)灭菌柜、洁净室空气净化系统、培养箱等均应按相应要求先行验证并符合规定。
(2)验证试验所用菌株传代次数不得超过5代[1];试验菌液要保存在2～8℃的冰箱内,可在1周内使用,但要求在每次接种时须重新计数,以保证稀释菌液的准确浓度。
(3)菌种处理和微生物鉴别必须与其他的微生物检查用洁净室严格分开,并保持相对负压。每次试验结束后要对洁净室层流台及整个实验室环境进行消毒,人员离开后,打开臭氧消毒。所有与菌种相关的试验废物弃物均应经过灭菌处理后方可丢弃。
(4)按2005年版中国药典规定方法,对活骨胶囊进行的平皿菌落计数方法和控制菌检查方法的验证试验结果表明:本法不会对活骨胶囊可能存在的各类微生物产生抑制作用,可用平皿法进行活骨胶囊的微生物限度检查。若药品生产工艺变更、组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时,细菌、霉菌及酵母菌计数方法和控制菌检查方法应重新验证。
参考文献
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京:化学工业出版社,2005:附录ⅩⅢC.