健足颗粒对糖尿病皮肤溃疡大鼠血清NO ET-1水平的影响

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收稿日期:2009-11-03

基金项目:浙江省中药现代化专项资金资助项目(浙财建字[2005]241号)

作者简介:黄在委(1977-),男,浙江杭州人,主治医师,研究方向:中医药治疗糖尿病及并发症的临床与实验研究。

通讯作者:柴可夫(1960-),男,浙江杭州人,主任医师、教授,博士研究生导师,博士,研究方向:中医药治疗糖尿病及并发症的临床与实验研究。

摘 要:目的:观察健足颗粒(加减防己黄芪汤)对糖尿病皮肤溃疡大鼠血管内皮功能的影响。方法:选用SD雄性大鼠90只,随机选取6只为正常对照组,其余大鼠以尾静脉注射四氧嘧啶40mg/kg,筛取符合糖尿病诊断标准的大鼠用于建立糖尿病皮肤溃疡模型,并随机分成6组,模型对照组、健足颗粒干预的高、中、低剂量组,中药对照组、西药对照组。实验结束后断头取血检测NO、ET-1含量以观察健足颗粒对血管内皮功能的影响。结果:与模型组比较,各治疗组大鼠血清NO含量均有不同程度升高,而血浆et-1含量却有不同程度的降低,其中以健足颗粒高剂量组变化最明显(P

关键词:糖尿病;皮肤溃疡;一氧化氮;内皮素-1;防治;健足颗粒;防己黄芪汤

中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1673-7717(2010)04-0837-03

Effects of JIANZU Granule on Nitric Oxide and Endothelin-1 in Rats with Diabetic Skin Ulceration (DSU)

HUANG Zaiwei,CHAI Kefu,SONG Guangming,JIN Yi

(Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou 310053,Zhejiang,China))

Abstract:Objective:To observe the effects of JIANZU Granule (Modified Fangji Huangqi Decoction) on vascular endothelial function of Rats with Diabetic Skin Ulceration (DSU).Methods:90 SD rats in male were randomized into two groups, namely Normal Control Group (NCG) with 6 rats, Model Group(MG) of 84 rats with tail vein injection of alloxan 40mg/Kg. Selecting the rats meeting the diagnostic criteria of Diabetes to establish Diabetic skin ulcer model for further observation, then randomly divided into 6 groups, Model Control Group(MCG), JIANZU Granule (JZG) High-dose Group, Middle-dose Group and Low-dose Group, Tang Maikang Control Group (TMCG), Metformin plus 654-2 Control Group(MNCG).In the end of the experiment, it was decapitated blood test NO, ET-1 to observe the effects of JZG on vascular endothelial function.Results:Compared with MCG, serum NO levels were increased to some degrees in all treatment groups, but the plasma ET-1 levels have different degrees of reduction. The most obvious change was observed in the High-dose Group (P

Key words:diabetes mellitus;skin ulceration;NO;ET-1;prevention and treatment;JIANZU Granule;Fangji Huangqi Decoction

据国际糖尿病联合会最新公布的数字,目前全球糖尿病患者为2.46亿人,到2025年这一数字预计将增至3.8亿[1]。随着人民生活水平的提高,生活方式、习惯等的改变,糖尿病及其并发症的发病率大幅度上升,已经成为严重危害人类健康的疾病之一,并成为医疗费用增高的一个主要原因。皮肤溃疡是常见的糖尿病并发症之一,往往反复发作,迁延不愈,形成顽固难愈性溃疡,治疗不及时会向深部发展,甚至截肢。笔者根据临床实践认为糖尿病皮肤溃疡发病基础是脾虚失运,浊瘀经络,积久成毒,化腐伤肌。故提出运脾通络法是防治糖尿病足(皮肤溃疡)的有效方法[2-3]。据此笔者选用《金匮要略》之经方防己黄芪汤为基本方,结合临床化裁出8味中药,制成健足颗粒。本研究通过观察健足颗粒(加减防己黄芪汤)对糖尿病皮肤溃疡大鼠血清NO、ET-1水平的影响,以探讨其作用机制。

1材料与方法

1.1实验动物

清洁级雄性SD大鼠90只,体重(200±20)g,由浙江省实验动物中心提供,许可证号:SCXK(浙)2003-0001。

1.2药物

健足颗粒(炙黄芪15g,苍术10g,当归10g,汉防己10g,忍冬藤15g,玄参10g,鬼箭羽10g,威灵仙10g),由浙江省中药研究所制剂室提供。盐酸二甲双胍片:正安医药(天津)有限公司,批号:060509。糖脉康颗粒:成都中汇制药有限公司,批号:060914。消旋山莨菪碱片:杭州民生药业集团有限公司,批号:107D285。

1.3糖尿病皮肤溃疡大鼠模型的建立

给大鼠喂饲高脂饲料(50%基础饲料、10%熟猪油、25%蔗糖、15%蛋黄粉)1周,在大鼠尾静脉注射四氧嘧啶40mg/kg,5天后测血糖,筛选血糖值在20～33mmol/L之间为符合标准的糖尿病大鼠,建立糖尿病大鼠模型。然后用戊巴比妥钠麻醉大鼠后,用刀片在大鼠小腿划一个约1cm长的切口,深达皮下,并注入1mL金黄色葡萄球菌悬液(由浙江中医药大学生命科学学院提供),以引起皮肤溃疡、甚至坏死,制作成大鼠皮肤溃疡模型。

1.4 实验动物分组

选用清洁级SD雄性大鼠90只,体重(200±20)g,习惯性饲养1周后,随机选取6只为正常对照组(正常组),其余84只均以尾静脉注射四氧嘧啶40mg/kg,除8只不符合糖尿病诊断标准的大鼠予以剔除外,76只用于建立糖尿病皮肤溃疡模型造模,随机分成6组,模型对照组16只、健足颗粒干预的高剂量组(健足颗粒高剂量)12只、中剂量组(健足颗粒中剂量)12只、低剂量组(健足颗粒低剂量)12只、中药糖脉康对照组(中药对照组)12只、化学药物二甲双胍加654-2阳性对照组(西药对照组)12只。

1.5给药剂量与方法

健足颗粒(加减防己黄芪汤)根据临床用药剂量,折算成大鼠使用剂量,高、中、低剂量分别是:12、6、3g/kg(分别为成人临床日用药量的20、10、5倍,成人体重按60kg计);糖脉康颗粒剂量10g/kg(成人日用药量的10倍,体重按60kg计);盐酸二甲双胍片125mg/kg,消旋山莨菪碱片5mg/kg(成人日用药量的10倍,体重按60kg计)。各组药物在灌胃时根据大鼠体重,稀释成相同的用量。正常对照组给予基础饲料,同时用与各药物治疗组相同用量的生理盐水灌胃,每日1次。其余6组除给予高脂高糖饲料外,模型组还用与各药物治疗组相同用量的生理盐水灌胃,每日1次;健足颗粒高、中、低剂量组分别用12、6、3g/kg的健足颗粒灌胃,每日1次;中药对照组用10g/kg的糖脉康溶解液灌胃,每日1次;西药对照组用125mg/kg的二甲双胍片灌胃,8周后开始联合消旋山莨菪碱片5mg/kg溶解液灌胃,每日1次。各组均自由饮水,干预治疗10周。

1.6 NO和ET-1水平的检测

血清一氧化氮(NO)浓度采用化学法测定,其应用原理是NO遇氧及水生成硝酸盐及亚硝酸盐,后二者遇硝酸盐显色剂可生成淡红色偶氮化合物,通过比色可间接测知NO浓度。NO测定试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。血浆ET-1水平采用放射免疫法(RIA)测定,试剂盒由北京北方生物技术研究所提供。所有样本均由专人严格按产品说明书操作。

1.7 统计学方法

采用SPSS 11.5统计软件。计量资料数据以均数±标准差(±s)表示,采用方差分析对各组均数进行显著性检验,P

2结 果

2.1血清一氧化氮(NO)的变化

研究结果显示,与正常组比较,模型组大鼠血清的一氧化氮NO含量明显偏低。与模型组比较,各治疗组大鼠血清一氧化氮NO含量均有不同程度升高,其中健足颗粒高剂量组最明显(P

表1 各组大鼠血清NO水平的变化

组别血清NO(μmol/L)

正常组38.90±9.87

模型组10.32±3.13

健足颗粒高剂量24.65±4.95***

健足颗粒中剂量19.74±7.04**

健足颗粒低剂量15.10±5.22*

中药对照组17.10±7.26*

西药对照组13.16±4.38

注:与正常组比,P

2.2血浆ET-1水平的变化

结果显示,与正常组比较,模型组大鼠的血浆内皮素-1(ET-1)含量明显偏高。与模型组比较,各治疗组糖尿病皮肤溃疡大鼠的血浆ET-1含量却有不同程度的降低,其中健足颗粒高剂量组降低最明显(P

表2 各组大鼠血浆ET-1水平的变化

组别血浆ET-1(pg/mL)

正常组59.28±3.41

模型组90.15±8.31

健足颗粒高剂量73.34±7.33***

健足颗粒中剂量80.66±5.73***

健足颗粒低剂量83.22±6.01*

中药对照组86.88±4.71

西药对照组88.48±7.02

注:与正常组比,P

图1 NO和ET-1水平

3讨 论

糖尿病皮肤溃疡属中医“消渴”、“阴疽”、“溃疡”等范畴。中医学认为,糖尿病及其并发症多以阴虚为本,燥热为标,兼杂湿浊,日久内阻气机,而致脏腑功能失调,气血不生;外蕴肌肤,壅滞脉道,瘀阻经络,导致气血不通,肢体失养。如阙华发等[4]指出“虚”、“瘀”是糖尿病溃疡创面难以愈合的关键。笔者研究认为脾虚失运乃糖尿病皮肤溃疡的发病基础,运脾通络是治疗糖尿病及其并发症的重要环节。如《素问•太阴阳明论》云:“脾病而四支不用何也?岐伯云:四支皆禀气于胃,而不得至经,必因于脾,乃得禀也。今脾病不能为胃行其津液,四支不得禀水谷气,气日以衰,脉道不利,筋骨肌肉皆无气以生,故不用焉。”

研究表明,糖尿病皮肤溃疡的发病原因主要是血管病变、神经病变、并发感染等3个方面。而血管病变导致血液循环障碍,局部组织呈慢性缺血、缺氧状态,直接影响溃疡愈合的程度及其预后,并且由于局部组织的缺血、缺氧,易于并发感染,导致溃疡发生且难以愈合[5-6]。故认为血管病变是糖尿病皮肤溃疡发病的重要病机之一。血管内皮功能的改变是糖尿病血管并发症的始发因素。而ET是由血管内皮细胞合成和释放的具有强烈缩血管和促进细胞生长增殖的活性多肽[7];NO 是由内皮细胞合成释放的一种具有很强舒血管作用的血管活性物质,被称作内皮源性舒张因子;在保持血管稳定上起关键作用,NO还可抑制血小板的凝集,血管平滑肌的增殖以及抑制白细胞黏附于血管壁。范冠杰[8]认为NO和ET是最强的内源性血管舒张和收缩因子。

本研究结果显示,与正常组比较,模型组大鼠血清NO含量显著降低、而血浆ET-1水平均显著升高,说明糖尿病皮肤溃疡大鼠血管内皮功能受损也是糖尿病皮肤溃疡发病的重要原因。而血管内皮功能受损被认为是导致糖尿病微血管病变和大血管病变的主要机制。本实验通过不同剂量的健足颗粒干预治疗后,与模型组比较,各治疗组能有不同程度的升高大鼠血清NO含量,降低血浆ET-1含量,对大鼠的NO、ET-1水平起到调节、修缮作用,尤其是健足颗粒高剂量组改善最为明显,说明健足颗粒(加减防己黄芪汤)对糖尿病大鼠血管内皮功能具有良性调节作用,这可能是健足颗粒干预糖尿病皮肤溃疡大鼠的机制之一。这种调节、修缮和恢复内皮功能的作用也正与健足颗粒的益气理脾祛湿、活血通络解毒等功效相一致,通过中药的干预治疗,改善糖尿病大鼠皮肤、肌肉组织缺血、缺氧状态,促进局部的血液循环和创面愈合,从而有效防治了糖尿病皮肤溃疡的进一步发展。

参考文献

[1] 张云华, 陆汉军. 2型糖尿病及其并发症中西医结合诊疗与预防[M].武汉:华中科技大学出版社,2009:1-2.

[2] 宋光明,柴可夫,杨明华,等.论运脾通络法防治糖尿病足[J].中华中医药学刊,2008,26(9):1972-1973.

[3] 柴可夫,黄晓玲,铁俊文,等.2型糖尿病中医湿热困脾证的基因表达研究[J].浙江中医药大学学报,2009,33(5):688-692.

[4] 阙华发,张臻,王云飞,等.益气化瘀方对糖尿病溃疡大鼠Smad3、Smad4表达的影响[J].上海中医药杂志,2007,4l(2):24-27.

[5] 青春,林炜栋,刘琰,等.糖尿病合并创面难愈等并发症形成机制的研究[M]//陆树良.烧伤创面愈合机制与新技术.北京:人民军医出版社,2003:135-154.

[6] 王争,张纪蔚,张柏根.糖尿病足动脉缺血患者骨骼肌血管内皮生长因子基因表达[J].中华外科杂志,2002,40(7):505-507.

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[8] 范冠杰,李晶晶,罗广波,等.糖足方治疗糖尿病足及其对血浆NO、ET、VEGF的影响[J].广州中医药大学学报,2006,23(5):383-386.