拉米夫定治疗时发生HBV P基因区耐药变异的相关预测因素研究
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[摘要]目的研究如何选择病例进行拉米夫定的治疗，建立治疗中耐药发生的预测指标和方法。方法对拉米夫定治疗中出现hbv P基因区耐药的患者进行回顾性研究，观察治疗前的生化指标、部分个体因素，及治疗中HBV-DNA水平的变化。结果患者年龄≥40、HBeAg阳性及ALT＜2*ULN组耐药发生率高于对照组（P＝0.023、P＝0.031、P＝0.036）；LAM治疗中，HBeAg阳性患者治疗4～24周期间的DNA下降值＜1 log10 copies/ml组耐药发生率高（P＝0.048），HBeAg阴性组治疗4周时DNA值≥4 log10 copies/ml组耐药发生率高（P＝0.048）。结论患者年龄≥40、HBeAg阳性及ALT＜2*ULN是接受拉米夫定治疗的耐药危险因素；LAM治疗中，可用血清HBV-DNA水平为指标建立耐药早期预测的方法。
关键词：病毒乙肝耐药检测
中图分类号：R511 文献标识码：B 文章编号：1004-7484（2011）11-0050-04
核苷类药物不能清除细胞内的HBVcccDNA，因此需要持续用药抗病毒治疗，而长时间的用药治疗会引起基因耐药变异，耐药率亦会逐年增高[1]。研究显示，应用拉米夫定治疗1年后耐药发生率为14%～36%，2年为38%，3年为49%，4年为66%，治疗5年后耐药发生率高达70%以上[2]。HBV耐药问题已成为临床上制约抗病毒疗效的重要原因。
1材料与方法
1.1 病例选择
医院门诊及住院患者符合2005版《慢性乙型肝炎防治指南》诊断标准，HBsAg阳性。口服LAM抗病毒治疗后，确定其相关HBV P基因变异者共20例。
1.2 研究方法
回顾性研究核苷（酸）类似物抗病毒治疗1年内产生耐药的患者资料，同时选择25例LAM治疗一年且未发生耐药的作对照组。
1.3 仪器试剂
1.3.1 血清HBV-DNA 检测：杭州博日Line-Gene实时荧光定量PCR仪，试剂由中山大学达安基因中心提供。
1.3.2 HBV P区变异检测：HBV P区耐药变异检测试剂盒：美国ABI BigDye 3.1 测序试剂盒，日本TaKaRa生物公司的ExTaq酶。仪器为美国ABI 310遗传分析仪。检测HBV P基因的RT区169，173，180，181，184，194，202，204，233，236，241，250等常见基因耐药位点发生。
1.3.3ALT、TBIL检测：采用日立7600全自动生化分析仪，试剂厂家为潍坊康华。ALT的ULN为40 U/L。
1.4 统计学分析
用SPSS16.0软件进行统计学分析。用均数±标准差(x±S)来表示正态分布的指标，P＜0.05为差异具有统计学意义。
2结果
2.1 治疗前患者基线情况与耐药的关系
本次研究共45例患者，患者年龄21～65岁，平均年龄35.4±10.2岁。ALT＜2*ULN组较ALT≥2*ULN的耐药率高；HBeAg阳性组较阴性组耐药率高；年龄≥40组较＜40的耐药率高。其余分组差异无统计学意义（见表1）。
表1年龄、性别、家族史、基线ALT、HBV-DNA及HBeAg 对基因型耐药的影响（例，%）
变 量 耐药组（n=20) 对照组（n=25) P值
性别 P=0.592
男 12（48.0） 13（52.0）
女 8（40.0） 12（60.0）
家族史 P=0.463
有 11（50.0） 11（50.0）
无 9（39.1） 14（60.9）
年龄(Y) P=0.023
＜40 6（27.3） 16（72.7）
≥40 14（60.9） 9（39.1）
ALT（U/L） P=0.036
＜2*ULN 15（57.7） 11（42.3）
≥2*ULN 5（26.3） 14（73.7）
TBIL P=0.999
mmol/l ＜34 8（44.4） 10（55.6）
≥34 12（44.4） 15（55.6）
HBV-DNA P=0.945
(log10 copies/ml)
＜8 7（43.8） 9（56.2）
≥8 13（44.8） 16（55.2）
HBeAg P=0.031
阳性 12（63.2） 7（36.8）
阴性 8（30.8） 18（69.2）
2.2 HBeAg 阳性者治疗前与治疗中HBV-DNA水平与耐药的关系
19例HBeAg 阳性患者，耐药组12例，对照组7例。基线时、治疗4周、12周、24周时两组的DNA（log10 copies/ml）水平均为逐渐降低，对两组不同时期的DNA水平进行比较，差异无统计学意义（见表2）。
表2HBeAg 阳性患者中耐药组与对照组不同时期的HBV-DNA(log10 copies/ml)水平
治疗前 治疗后
基线时 4周 12周 24周
耐药组 8.81 5.07 4.41 4.35
对照组 8.83 5.3 4.31 4.05
P值 0.950 0.653 0.967 0.366
2.3 HBV患者HBeAg 阴性组治疗前与治疗中HBV-DNA水平与耐药的关系
26例HBeAg 阴性患者，耐药组8例，对照组18例。基线时、治疗4周时两组的DNA（log10 copies/ml）水平趋势均为降低，对两组不同时期的DNA水平进行比较，差异无统计学意义（见表3）。
表3耐药组与对照组在治疗前与治疗4周时DNA(log10 copies/ml)水平
治疗前基线时 治疗后4周
耐药组 8.77 5.61
对照组 7.41 3.9
P值 0.344 0.179
2.4 HBeAg阳性组治疗4～24周时DNA下降值与基因型耐药发生的关系
根据治疗4周到24周期间DNA下降值是否＜1 log10 copies/ml分为两组，＜1 log10 copies/ml组中耐药组有9例（81.8%），对照组有2例（18.2%）；≥1 log10 copies/ml组中耐药组有3例（37.5%），对照组有5例（62.5%）。对两组进行比较差异有统计学意义（见表4）。
表4HBeAg阳性组4～24周DNA(log10 copies/ml)下降值与基因型耐药的关系
DNA下降值 耐药组 对照组 P值
＜1 9（81.8） 2（18.2） 0.048
≥1 3（37.5） 5（62.5）
2.5 HBeAg阴性组治疗4周时DNA值与发生基因型耐药的关系
根据治疗至4周时DNA水平是否＜4 log10 copies/ml分为两组，≥4 log10 copies/ml组中耐药组有7例（70.0%），对照组有3例（30.0%）；＜4 log10 copies/ml组中耐药组有1例（6.3%），对照组有15例（93.7%）。对两组进行比较差异有统计学意义（见表5）。
表5 HBeAg阴性组治疗4周时HBV-DNA(log10 copies/ml)水平与基因型耐药的关系
DNA载量 耐药组 对照组 P值
＜4 1（6.3） 15（93.7） 0.001
≥4 7（70.0） 3（30.0）
3讨论
本次研究显示基线时HBV-DNA水平及个体因素中的性别、家族史与耐药发生无关。国内[3]关于233例CHB患者口服拉米夫定的一项研究显示，HBeAg阳性的患者在治疗前HBV-DNA相对低水平的，可有较低的病毒突破率和取得较好的疗效。本研究却发现基线HBV-DNA、TBIL水平对耐药的发生无关，这可能与治疗单位对HBV-DNA水平较低患者的未施行临床抗病毒治疗，治疗患者的HBV-DNA、TBIL水平普遍较高有关。基线患者年龄≥40、HBeAg阳性及ALT＜2*ULN的可作为患者易产生拉米夫定耐药的危险因素。人体的免疫应答能力与年龄有关，患者的年龄低其免疫力相对更强能够持续地抑制HBV病毒的复制。一项用拉米夫定治疗慢性乙型肝炎的研究[4]，研究对象是HBeAg阳性的178位患者，同样显示年龄小于40的患者更有免疫力，治疗中容易获得持续性应答的效果；关于HBeAg阴性患者的一项研究[5]，共有518名病例，也提示年龄小于40可作为治疗24周时的治疗应答的预测指标。这与本次研究年龄≥40患者拉米夫定治疗中更容易产生基因型耐药的结果相印证。对于HBeAg状态与拉米夫定治疗效果的关系，相关报道认为HBeAg阴性患者在拉米夫定治疗时可能有更高的应答率，与本研究的结果一致，HBeAg阴性患者能取得更好的疗效，同样耐药率相对更低。基线ALT水平分析显示ALT＜2*ULN组在拉米夫定治疗后的效果往往不好，更易产生HBV变异发生耐药。ALT与肝细胞的炎症程度及机体反应状态相关，ALT升高是肝损害的外在表现。治疗前ALT水平是影响拉米夫定疗效的重要因素，具有较好的疗效预测价值。治疗前ALT水平较高的患者疗效显著，一项172名慢性乙型肝炎拉米夫定治疗的疗效研究[6]，治疗前ALT水平≥200U/L组34例，其中完全应答有16例，而138例ALT＜200U/L组CHB患者中完全应答仅28例，ALT水平较高组的患者疗效显著（P＜0.01）。同样一份亚洲关于HBeAg阳性乙型肝炎患者的研究，共345例服用拉米夫定治疗的 [7]，结果显示ALT水平影响HBeAg的血清转换，基线ALT≥5*ULN与ALT＜2*ULN组的患者1年后HBeAg血清转换率分别为64%、5%。本研究提示基线ALT＜2*ULN是产生HBV耐药的危险因素，TBIL与耐药发生无关。临床多用降酶和黄疸治疗，患者的ALT水平并非反映个体的实际免疫情况，因此ALT作为预测耐药的指标应根据患者的用药情况决定，而TBIL在治疗前和治疗中均无法适用耐药预测。
Keffe教授提出了应用核苷（酸）类似物抗病毒治疗慢性乙型肝炎时适用的“路线图”概念[8]。根据“路线图”概念的内容，核苷（酸）类似物治疗24周时的HBV-DNA载量是疗效管理的重要因子。后来有国内研究治疗4周时HBV-DNA载量及4周时HBV-DNA下降2 log10 copies/ml,对治疗48周的疗效有预测价值。本研究发现不同HBeAg状态在选择耐药预测方面有很大不同。HBeAg阳性组的不同时期：基线和治疗4周、12周及24周，其HBV-DNA水平的差异没有统计学意义。HBeAg阴性组的HBV-DNA水平从治疗4周开始低于1000的病倒出现。贾继东等研究显示拉米夫定治疗24周时，病毒水平下降不理想提示发生耐药的可能性增加，本次研究发现HBeAg阳性组治疗4～24周时DNA下降值与基因型耐药发生有关系，下降值＜1 log10 copies/ml组中耐药组有9例（81.8%），对照组有2例（18.2%）；≥1 log10 copies/ml组中耐药组有3例（37.5%），对照组有5例（62.5%），两组差异有统计学意义（P=0.048），因此可把治疗4～24周时DNA下降值＜1 log10 copies/ml作为HBeAg阳性的乙型肝炎患者治疗中的耐药预测因素。HBV患者HBeAg 阴性组治疗前与治疗4周时HBV-DNA水平耐药与对照组的差异没有统计学意义。但从治疗第4周开始HBV-DNA水平已开始表现不同，对照组已有低于3 log10 copies/ml的病例出现。本研究发现以HBeAg阴性组耐药发生与治疗至4周时以DNA水平是否低于4 log10 copies/ml有关系，＜4 log10 copies/ml组中耐药组有7例（70.0%），对照组有3例（30.0%）；≥4 log10 copies/ml组中耐药组有1例（6.3%），对照组有15例（93.7%）。两组差异有统计学意义（P=0.001）。Gauthier的研究[9]以及Yuen的研究[10]显示，拉米夫定治疗24周时，如果患者血清HBV-DNA水平＜4 log10 copies/ml,病毒耐药情况较少发生，与本研究中HBeAg阴性的乙型肝炎患者治疗时的分析结果一致。因此可把治疗4周时DNA值＜4 log10 copies/ml作为HBeAg阴性的乙型肝炎患者治疗中的耐药预测因素。核苷（酸）类似物抗病毒治疗过程中HBV的衰减呈2相模式。在第1时相，病毒载量迅速降低，反映了病毒从血清中被迅速抑制的过程，第1时相下降的斜率反映了抗病毒药物的强度；在第2时相，病毒载量下降开始变得缓慢，反映了病毒从感染的肝细胞内被清除的过程[11,12]。第4周为第1时相和第2时相的过渡点。这可能是解释治疗4周时DNA值＜4 log10 copies/ml作为HBeAg阴性的乙型肝炎患者治疗中的耐药预测因素的理论依据。
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