反相高效液相色谱法测定尿样中维生素C、B 1 和B 2 的浓度
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【关键词】 色谱法
水溶性维生素与人体的生长发育和健康有着密切关系，在人体的生命活动中具有十分重要的作用，它们在人体内的含量是衡量一个人的健康指标。目前VitC，VitB 1 和VitB 2 传统测定方法中，VitC常用2，4-二硝基苯肼比色法和2，6-二氯靛酚钠盐滴定，这两个方法灵敏度较低，特异性差，目前一般科研项目都不采用这个滴定法；Vit B 1 和Vit B 2 可用荧光法，但该法前期处理操作繁冗，费时费力，其处理方法和过程增加了影响检测精确度欠佳的人为因素。本文数据采用液相色谱法分离检测。
1 实验部分
1.1 仪器 SY5000LIQUID CHROMATOGRAPII（BEIFN）具UV/VIS检测器，色谱柱：Lichrosphcr C18，4.6×250，5μm，TL9900色谱数据工作站。
1.2 试剂 本实验所用水为石英亚沸蒸馏水，以0.45μm水性微孔滤膜过滤。所用试剂均为分析纯（AR），甲醇为一级色谱纯，标样维生素C、B 1 、B 2 贮备液以0.01mol/L草酸配制，在4℃冰箱中保存。VitC临用新配。流动相A：0.05ml/L KH 2 PO4缓冲液（pH6.00）；流动相B：甲醇。均经0.45μm水性微孔滤膜过滤，超声波脱气后使用。整个操作应避光，且操作过程要迅速，以防维生素被氧化。
1.3 样品处理 检测学生起床后将昨晚尿排空，空腹以200ml水送服VitC500mg，VitB 1 5mg和VitB 2 5mg，然后收集服药后4h内排出的尿于1000ml广口棕色瓶中，并加4%的草酸防护，尿液经0.45μm微孔过滤器过滤 [4] ，超声波脱气后即可上色谱柱分离检测。
1.4 色谱仪工作条件 色谱检测的流动相由磷酸二氢钾A和甲醇B组成，其比例为90∶10和65∶35。流速1.0ml/min，柱温：室温，波长：266nm，柱前压：168～240ATM。
1.5 标准曲线制作 配制一系列不同浓度的混合液，经检测得出的数据作出如下3种维生素的标准曲线（如图1示）。
1.6 色谱检测 分时间段采样，每采一批样有30个左右尿样。样品处理后，按标准样品检测的条件，以外标法检测VitC、VitB 1 和VitB 2 ，经TL9900色谱数据工作站处理检测出的数据和图形。
2 检测结果
经检测，得出样品中所含3种维生素的量，通过分析可得出如下结果（图2为一个样品的VitC、VitB 1 和VitB 2 3种维生素的色谱分析图）：
色谱法检测得此样品中VitC、VitB 1 和VitB 2 的峰高分别为1805mV、40mV和386mV，从标准曲线计算出其4h内排出尿样中的三种维生素的量分别为2.58mg、0.44mg和0.42mg。从五个斑151个尿样检测结果来看，VitC缺乏的占检测总数的15.23%，不足的占13.90%，正常的占70.87%；VitB 1 缺乏的占1.99%，不足的占3.31%，正常的占94.70%；VitB 2 不足的占16.56%，正常的占52.31%，良好的占31.13%（正常以上的占83.44%） [1] 。
3 讨论与总结
3.1 检测波长的选择 待检测的3种维生素中，VitC在261nm，VitB 1 在246nm，VitB 2 在260nm波长处有最大的吸收 [2，3] ，本次实验曾分别选用以上3种波长检测这三种维生素混合液，以上波长都不是这3种维生素混合液的最大吸收波长，经试验，最后确定266nm波长为三种待检测维生素的最佳检测波长。
3.2 回收率 测得人体尿样的3种维生素的含量，再加入已知浓度的标准品，混合后按1.6项操作，测其含量，得出其平均回收率的范围是90.12%～99.85%，变异系数在1.98%～6.56%之间，说明此种方法检测人体尿样中的维生素C、B 1 和B 2 3种水溶性维生素的含量是可靠的。
3.3 流动相确定 流动相由磷酸二氢钾缓冲液和甲醇组成，本实验曾以不同比例的流动相和波长对3种维生素C、B 1 、B 2 进行反复分离检测。通过实验，最终摸索出检峰形好，保留时间短的流动相组成比例。在磷酸二氢甲缓冲液∶甲醇=90∶10情况下，VitC保留时间在2.280～2.300min之内，VitB 1 在5.250～5.400min之内，VitB 2 在20min之后。此种情况分析一个的混合样至少需要25min（含平衡时间）。 在流动相比例65∶35的情况下，VitB 1 保留时间9.120～9.310min。中VitC和VitB 1 出峰不好，拖尾严重。本实验曾试行以梯度洗脱法检测，可将3种维生素分开，但检测时间长，至少在25min以上，且出现拖尾情况。考虑到本实验要检测的样品数目多，需以尽快的速度检测，故采取分步检测法：在流动相比例90∶10和65∶35情况下分别检测VitC、VitB 1 和VitB 2 ，两次检测合计不用20min，且它们分离得好，波型都是VV波型。
3.4 标准样品溶剂的选择 在VitC、VitB 1 和VitB 2 的标准溶液配制中，本实验曾采用盐酸、偏磷酸和草酸作溶剂。从实验情况来看，草酸是以上3种维生素较好的溶剂，其获得检测数据误差小，检测波型好，这可能是草酸对VitC、VitB 1 和VitB 2 具有更好的稳定作用。
3.5 流速 流速对检测精确度影响不大，但对检测保留时间影响较大。如流速1.0ml/1min，柱前压稍大一些，在200～240ATM之间，但仪器仍然可承受；如果流速变小，如0.8ml/min，虽然柱前压随之变小，约168atm，但保留时间却延迟5～10min，这对要检测大量样品是不可取的。故本实验采用1.0ml/min流速。
3.6 待检样品处理的注意事项 由于维生素类物质稳定性不好，样品在检测之前，加入适当的保护剂，力求低温保存，防强光照，争取在最短时间内进行检测，以防维生素被氧化。这些都是取得较高检测精确度的重要性举措。
3.7 总结 液相色谱法检测快捷，特异性好，灵敏度高；加上仪器具有色谱数据工作站软件，对数据和图形处理极为方便。故该方法是检测维生素物质的理想方法。
参考文献
1 于守祥，刘志诚.营养与食品卫生监督检测方法指南.北京：人民卫生出版社，1980，9.
2 潘建国，王开发.高效液相色谱法同步测定花粉中的水溶性维生素.上海：同济大学出版社，2001，581-583.
3 成志强，孙成均.反相高效色谱法同时测定食品和多维片中8种水溶性维生素.分析化学，2001，（9）：1068-1071.