RP-HPLC法测定闽产红豆杉树皮中紫杉醇的含量
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[摘 要]目的：建立rp-hplc法测定闽产红豆杉树皮中紫杉醇的含量的方法。方法：采用岛津RP-C18(250 mm × 4.6 mm，5.0 μm)色谱柱，柱温25℃；流动相为V（甲醇）:V（水）=70:30，流速1.0 mL/min；检测波长227 nm。结果：紫杉醇在25～150μg/mL的范围内线性良好（r = 0.9991），平均回收率为99.31%，RSD为0.63%；三年生、四年生和五年生的红豆杉树皮中紫杉醇的含量分别为0.0296%、0.0312%和0.0307%。结论：本实验方法相对稳定、准确、可靠，操作简便，为进一步研究闽产红豆杉树皮中紫杉醇的提取纯化提供了科学依据。
[关键词]闽产红豆杉；紫杉醇；高效液相色谱
红豆杉(Taxus spp. )又被称为紫杉、赤柏松，是远古第四纪冰川后遗留下来的世界濒危珍惜药用植物，是天然抗癌药物紫杉醇的主要原料，素有“植物黄金”之称。我国红豆杉有云南、东北、和中国红豆杉4个种及南方红豆杉1个变种，南方红豆杉(Taxus. mairei)又称美丽红豆杉，产于我国长江流域以南，在我国分布最为广、生长最快的红豆杉属植物。紫杉醇是具有显著抗癌效果，能有效阻止癌细胞的增值，是治疗转移性卵巢癌、乳腺癌、鼻咽癌、肺癌、食道癌、晚期卵巢癌、前列腺癌等都有显著疗效；对恶性黑色素瘤、头颈部肿瘤和白血病等也有明显疗效。本试验以红豆杉树皮为研究对象，建立了应用RP-HPLC法测定闽产红豆杉树皮中紫杉醇的含量的方法，对更加科学的开发利用红豆杉资源具有重要的科学意义。
1 仪器与材料
1.1 仪器
高效液相色谱仪（岛津LC-15），超声波清洗器（江苏昆山市超声仪器有限公司）；旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；电子天平（BP211D，德国赛多利斯有限公司）；实验室纯水器EPED-10TH（南京易普易达科技发展有限公司）。
1.2 材料
闽产红豆杉树皮采自福建龙岩红豆杉基地。紫杉醇对照品，购于西安昊轩生物科技有限公司（其含量＞98.85%，HPLC外标法）。甲醇为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：RP-C18(岛津，250mm×4.6mm，5.0μm)。流动相：V（甲醇）:V（水）=70:30，流速：1.0mL/min，柱温：25℃，检测波长为227nm，进样量为20μL[7,8]。在该色谱条件下测定紫杉醇对照品溶液和闽产红豆杉树皮供试品溶液，色谱图见图1和图2，紫杉醇对照品的保留时间为16.286min，供试品色谱图中保留时间为16.115min是紫杉醇的色谱峰。
2.2 对照品溶液及供试品溶液的制备
对照品溶液的制备：精密称取紫杉醇对照品4.48mg，于10mL容量瓶中，用色谱甲醇溶解并稀释定容至刻度，摇匀，得紫杉醇对照品溶液（448μg/mL），待用。
供试品溶液的制备：取闽产南方红豆杉树皮细粉10 g，置于三角瓶中，加甲醇80mL，超声提取45min，过滤；滤渣重复超声提取二次，合并三次滤液，浓缩；二氯甲烷萃取浓缩液，萃取下层液用石油醚脱脂醇沉，得浸膏；色谱甲醇溶解浸膏并定容至10mL，滤过（0.45μm微孔滤膜），取滤液备用。
2.3 线性范围
取适量对照品溶液，用色谱甲醇稀释，紫杉醇浓度分别为25，50，75，100，125和150 μg/mL，各取20μL进行液相检测，记录紫杉醇色谱峰面积并分析。以紫杉醇浓度（C）(μg/mL)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为A=4.149C－9.738，r=0.9991，表明紫杉醇在25～150μg/mL范围内线性良好。
2.4 精密度试验
取已制备的对照品溶液20μL进行液相检测，重复6次，记录峰面积并计算含量。结果：紫杉醇含量的RSD为1.16%。
2.5 回收率试验
分别称取已知含量的红豆杉树皮粉末6份，每份约1g，按约等量精密加入紫杉醇对照品，按2.2项下方法处理，得供试液并测定紫杉醇含量，计算平均回收率（n=6）为99.31%，RSD为0.63%，结果见表1。
2.6 重复性试验
取同一批红豆杉树皮粉末6份，按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1色谱条件测定紫杉醇含量，RSD为1.48%，表明本实验方法重复性较好。
2.7 稳定性实验
取供试品溶液，分别于0、2、5、9、14、24h测定紫杉醇含量，记录6次色谱峰面积，计算紫杉醇峰面积的RSD为1.33%，表明供试品溶液在24h内基本稳定。
2.8 样品含量测定
对不同年份采集的3批红豆杉树皮按2.2项下方法处理，按2.1色谱条件进行测定（n=3），计算样品中紫杉醇的含量，结果：三年生、四年生和五年生的红豆杉树皮中紫杉醇的含量分别为0.0296%、0.0312%和0.0307%。
3 讨论
3.1 提取溶剂的考察
根据各种溶剂的毒性、成本及选择性，本实验选泽甲醇作为提取溶剂。甲醇在提取过程中不但可以除去较多杂质，而且毒性小、成本低、回收率高、是工业生产中选择性较好的溶剂。
3.2 萃取及脱脂溶剂的考察
红豆杉中紫杉醇的含量非常低，其他活性成分及杂质很多，甲醇提取物杂质复杂，很难进行含量测定。本实验将甲醇提取物进行二氯甲烷萃取，然后石油醚脱脂，除去大部分杂质，后进行测定，获得较为满意的结果。
本实验方法对不同年份闽产红豆杉树皮中的紫杉醇含量进行测定，结果表明：3批红豆杉树皮中紫杉醇含量差异不大。本实验方法相对稳定、准确、可靠，操作简便，为进一步研究闽产红豆杉树皮中紫杉醇的提取纯化提供了依据，为其资源的开发利用提供方法依据。
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