经静脉神经干细胞移植治疗难治性癫痫的实验研究
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132100吉林省吉林市中心医院神经内科
摘 要 目的：观察难治性癫痫模型静脉注射骨髓基质细胞后行为学及细胞形态学的改变，为难治性癫痫的临床治疗开辟新的途径，奠定理论基础。方法：将20只SD大鼠随机分模型组（A组）、移植组（B组），每组10只。在大脑立体定向仪上定位大鼠大脑海马CA3区，用微量进样器缓慢注入KA 1μl，制成难治性癫痫模型，然后B组经尾静脉注入Hoeschst33342标记的骨髓基质细胞1ml。取A组、B组鼠脑做HE切片，观察细胞形态学变化。结果：模型组的病理改变表现为海马周围卫星灶形成，腔隙层、辐状层和锥体细胞层有神经元吞噬现象，神经元缺失，其中CA3区表现得最为明显，齿状回苔醉状纤维出芽进行性增加。移植组较模型组海马周围卫星灶变小，细胞间隙较移植前减小，细胞增多且排列较整齐。结论：骨髓基质细胞具有修复癫痫病灶的能力。
关键词 癫痫 骨髓基质细胞 诱导分化 移植
doi:10.3969/j.issn.1007-614x.2011.11.005
难治性癫痫是指临床经过迁延，频繁的癫痫发作至少每个月4次以上，应用适当的第一线抗癫痫药物正规治疗，药物的血中浓度在有效范围内，无严重的药物不良反应，至少观察2年仍不能控制发作，影响日常生活，同时并无进行性中枢神经系统疾病或占位性病变者。目前常用的抗癫痫药物在神经系统、消化系统、心血管方面的不良反应影响了其临床应用。外科手术切除癫痫病灶的方法会对病人的远期生活质量产生很大的影响。80年代许多学者致力于从胚胎脑中分离出神经细胞移植入受损的脑内，使神经功能得到明显改善，这说明神经细胞移植是治疗神经疾病的有效手段【sup】［1，2］【/sup】。研究发现，骨髓中间质干细胞（MSCs）具有干细胞持续增殖和多向分化的特性，在一定的条件下可以分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞等【sup】［3］【/sup】，可自体移植，不存在免疫排斥反应，使其成为细胞移植治疗理想的选择。
采用4～6周龄，体重120～160g的SD大鼠为研究对象，将以Hoeschst33342标记的BMSCs经尾静脉注入难治性癫痫的大鼠体内，了解细胞移植治疗对癫痫大鼠神经功能的改善情况，从而探讨BMSCs对癫痫的修复和治疗作用，现报告如下。
资料与方法
实验动物：细胞培养选择4～6周龄Wister大鼠，动物模型选择6～8周龄Wister大鼠。
主要试剂：DMEM-LG培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、bFGF、EGF、Hoeschst33342、Percoll淋巴细胞分离液、戊巴比妥、海人酸、肝素、注射用青霉素钠、注射用链霉素。
主要仪器：细胞培养瓶、超净工作台、CO【sub】2【/sub】培养箱、倒置相差显微镜（Olympus）、离心机、电子天平、冰箱、烤箱、微量进样器、脑立体定向仪。
试剂配制：①低糖DMEM培养基的配制：DMEM培养基10.0g，青霉素105IU，链霉素105IU，NaHCO【sub】3【/sub】3.7g，加入三蒸水800ml，用稀盐酸调制pH值7.2，定溶1000ml，0.22μm微孔滤膜过滤。将配置的培养液进行负压抽滤除菌，分装备用。使用前加胎牛血清（终浓度10%）。②PBS液的配制：NaCl 8g，KCI 0.2g，Na【sub】2【/sub】HPO【sub】4【/sub】 1.15g，KH【sub】2【/sub】PO【sub】4【/sub】 0.2g，加三蒸水800ml，充分溶解后，调pH值7.2，定溶至1000ml。③胰蛋白酶的配制：称取0.25g胰蛋白酶，将其溶于100ml PBS液中，洁净工作台中抽滤分装备用。
试验方法：①大鼠骨髓基质细胞体外分离、培养：取4～6周龄Wister大鼠，1%戊巴比妥0.4ml/100g腹腔麻醉后拉颈处死，置于75%酒精中浸泡5～10分钟，再用75%酒精、3%碘酒消毒大鼠双侧下肢，在无菌条件下取大鼠双侧股骨和胫骨，剔除骨表面附着的肌肉组织，用无菌注射器抽取DMEM培养液，不含胎牛血清。从骨的一端冲洗骨髓腔，反复冲洗数次，另一端收集冲洗出来的骨髓，将收获的骨髓用5号针头注射器反复抽吸以打散组织块成为均匀的细胞悬液，然后以1:1的比例缓慢叠加到密度1.073g/L的percoll淋巴细胞分离液上，以2000转/分离心15分钟；收集中间乳白色的单个核细胞层，用含10%胎牛血清的低糖DMEM培养液调节细胞密度2×10【sup】5【/sup】/ml，然后将单个核细胞接种到25cm【sup】2【/sup】的塑料培养瓶中，置于37℃、5%CO【sub】2【/sub】饱和湿度的CO【sub】2【/sub】培养箱中培养，24小时后在倒置显微镜下观察细胞的贴壁情况，细胞贴壁生长轻摇瓶身不易脱落后，在倒置显微镜下可见不贴壁生长的红细胞。72小时后在无菌洁净工作台中首次全量换液，以后每2～3天全量换液1次。原代细胞培养约10天左右长满培养瓶的80%，呈成纤维细胞样生长，此时即可用0.25%胰蛋白酶消化原代细胞，在倒置显微镜下见贴壁细胞基本挛缩成类圆形，然后加入含胎牛血清的DMEM培养液终止消化，并将细胞液吹打均匀，接种于2个细胞培养瓶中进行1:2传代扩增培养。选取生长良好的第2代细胞，调解细胞密度为10【sup】5【/sup】/ml接种到24孔培养板，用滴管滴加bFGF（10μg/ml）及EGF（10μg/ml）各1滴/孔，放入CO【sub】2【/sub】培养箱中培养，以后每3～4天全量换液1次。4周后大量丝状纤维突起向神经元细胞和胶质细胞分裂扩增。②神经干细胞的收集和标记：选取生长良好的神经干细胞，用0.25%胰蛋白酶室温消化约3分钟，用含胎牛血清的培养液终止消化，PBS清洗，1000转/分离心，离心5分钟，收集细胞，将培养液Hoeschst33342加入大鼠BMSCs培养液中，终浓度50μg/ml，于37℃培养箱中避光共同培养24小时。然后PBS洗涤3次，去处未结合Hoeschst33342，收集细胞，用不含胎牛血清的LG-DMEM培养液将细胞制成细胞悬液，密度2×10【sup】5【/sup】/ml。放入冰块中备用（放置时间
统计学处理：各组数据用（X±S）表示，用SPSS10.0软件进行数据分析，P＜0.05差异有显著性，P＜0.01差异有非常显著性。结果
癫痫大鼠MSCs移植后HE染色：通过对A、B组大鼠脑组织HE染色片子进行比较发现，A组的病理表现为海马周围卫星灶形成（由于神经元受损造成的胶质细胞在神经元周围堆积），腔隙层、辐状层和锥体细胞层有神经元吞噬现象，神经元缺失，其中CA3区表现得最为明显, 该区神经元与正常锥体细胞相比，细胞体积明显变小，细胞排列不整齐、稀疏，细胞间隙增大，胞体不规则，细胞突起明显减少，胞核固缩，核仁不明显，损伤严重者细胞轮廓不明显,齿状回苔癣状纤维出芽进行性增加。移植组的海马卫星灶减小，细胞间隙较A组减小，细胞增多且排列较整齐。
讨 论
在实验中，BMSCs主要是通过尾静脉移植的方式，将预先用Hoeschst33342标记的BMSCs移植入癫痫大鼠体内，该方法的优点是对脑组织不造成2次损伤，移植物的数量不受限制，便于提高移植物达到缺血区域的数量【sup】［5］【/sup】。BMSCs被移植入鼠脑后能分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。有研究报道，在Parkinson's disease（PD）模型的小鼠或大鼠纹状体内植入BMSCs后可观察到BMSCs在脑内存活较长时间，随着时间的延长，迁移范围扩大，并在脑内表达神经丝蛋白（NF-M）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）、胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）和酪氨酸经化酶（TH）样免疫活性，PD大鼠或小鼠的异常行为也有所缓解【sup】［6,7］【/sup】。研究者在如何提高BMSCs分化为神经元的比例等方面进行了探索, 本实验采用bFGF、EGF作为增殖因子，成功地使BMSCs在体外得以扩增，成功地使BMSCs在体外转化为NSC和成熟的神经细胞，从而提高了BMSCs分化为神经元的比例。
BMSCs作为滋养层能诱导ESC大量分化为神经元。Kawasaki等【sup】［8］【/sup】研究发现，从颅骨BMSCs来的PA6细胞在与小鼠ESC共培养时，90%的ESC分化为NSC，其中52%可分化为神经元。此外，BMSCs还能直接诱导NSC分化为神经元。娄淑杰等【sup】［9］【/sup】采用细胞共培养和免疫组织化学染色方法，发现体外培养的中脑NSC在与成年大鼠BMSCs共培养7天后，NSC后代中神经元的比例明显高于自然分化组，提示BMSCs提供的微环境可明显促进NSC分化为神经元。BMSCs提高NSC后代中神经元的比例是由于它不仅能促进NSC的分化，而且还能增加分化后神经元的存活率，这是BMSCs分泌可溶性因子作用于NSC所致，细胞表面分子并没有参与BMSC对NSC的分化作用【sup】［10］【/sup】。
综上所述，BMSCs用于移植治疗难治性癫痫是可行的，也是有效的。
参考文献
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