以鲁西黄牛为受体的高产奶牛胚胎移植研究

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摘要：以自然的鲁西黄牛为受体，移植经性控技术生产的高产奶牛７日龄雌性冷冻胚胎，共移植合格受体牛５ ５１６头，移植后６０～８０ ｄ进行直肠孕检，怀孕２ ２２８头，移植准胎率为４０．３９％；共繁殖奶牛犊牛１ ３４６头，其中母牛１ ２７９头，公牛６７头，胚胎性别控制率为９５．０２％。左侧与右侧卵巢排卵移植准胎率分别为３５．１４％和４３．１５％，差异极显著（Ｐ＜０．０１）；春季与秋季的移植准胎率分别为３６．９３％和４３．５３％，秋季明显高于春季，差异极显著（Ｐ＜０．０１）；黄牛不同黄体级别Ａ级、Ｂ级、Ｃ级的准胎率分别为３９．１６％、４１．７０％和３３．４２％，Ａ级与Ｂ级移植准胎率差异不显著（Ｐ＞０．０５），Ｂ级与Ｃ级移植准胎率差异极显著（Ｐ＜０．０１）；移植单胚与双胚的受体牛准胎率分别为４０．７３％和３８．２４％，差异不显著（Ｐ＞０．０５）。

关键词：鲁西黄牛；胚胎移植；高产奶牛

中图分类号：Ｓ８２３．３＋６ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０12）07－1407-03

Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｍｂｒｙｏｓ ｆｒｏｍ Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ Ｃｏｗｓ ｔｏ Ｌｕｘｉ Ｃａｔｔｌｅ

ＪＩＡＮＧ Ｃｈｅｎｇ，ＳＩ Ｚｈｅｎ－ｓｈｕ，ＷＡＮＧ Ｇｕｉ－ｙｉｎｇ

（Department of Animal Sciences，Ｉｎｓｔｉｔｕtｅ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｌｉａｏｃｈｅｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌｉａｏｃｈｅｎｇ ２５２０５９，Sｈａｎｄｏｎｇ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｆｅｍａｌｅ－ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｅｍｂｒｙｏｓ ｏｆ ７ ｄａｙｓ ｆｒｏｍ ｈｉｇｈ ｙｉｅｌｄ ｃｏｗｓ ｗｅｒｅ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ ｔｏ ５ ５１６ Ｌｕｘｉ ｃａｔｔｌｅ ｉｎ ｎａｔｕｒａｌ ｅｓｔｒｕｓ， ２ ２２８ ｃａｔｔｌｅ ｗｅｒｅ ｐｒｅｇｎａｎｔ 60~80 ｄａｙｓ later according to ｒｅｃｔａｌ ｐａｌｐａｔｉｏｎ detection； ｔｈｅ ｐｒｅｇｎａｎｔ ｒａｔｅ ｗａｓ ４０．３９％． １ ３４６ ｃａｌｖｅｓ ｗｅｒｅ ｂｏｒｎ， including １ ２７９ ｆｅｍａｌｅｓ ａｎｄ ６７ ｍａｌｅｓ； ｔｈｅ ｆｅｍａｌｅ ｒａｔｅ ｗａｓ ９５．０２％． Ｔｈｅｒｅ was ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｇｎａｎｔ ｒａｔｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｌｅｆｔ ａｎｄ ｒｉｇｈｔ ｏｖａｒｙ ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ３５．１４％ ａｎｄ ４３．１５％， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ（Ｐ＜０．０１）． Ｔｈｅ ｐｒｅｇｎａｎｔ ｒａｔｅ ｉｎ ａｕｔｕｍｎ ｗａｓ ４３．５３％， ｗｈｉｃｈ was ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ｈｙｐｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｅ ３６．９３％ ｉｎ ｓｐｒｉｎｇ（Ｐ＜０．０１）． Ｔｈｅ ｐｒｅｇｎａｎｔ ｒａｔｅ ｉｎ ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｒｐｕｓ ｌｕｔｅｕｍ ｇｒａｄｅ Ａ， Ｂ ａｎｄ Ｃ ｗｅｒｅ ３９．１６％， ４１．７０％ ａｎｄ ３３．４２％， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ， ｗｈｉｃｈ ｓｈｏｗｅｄ ｎｏ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｇｒａｄｅ Ａ ａｎｄ Ｂ（Ｐ＞０．０５）， ａｎｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｇｒａｄｅ Ｂ ａｎｄ Ｃ（Ｐ＜０．０１）． Ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ｎｏ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｓｉｎｇｌｅ ａｎｄ ｔｗｉｎ ｅｍｂｒｙｏ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ（Ｐ＞０．０５）， ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｐｒｅｇｎａｎｔ ｒａｔｅ ｏｆ ４０．７３％ ａｎｄ ３８．２４％， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ （Ｐ＞０．０５）．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｃａｔｔｌｅ； ｅｍｂｒｙｏ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ； ｈｉｇｈ ｙｉｅｌｄ ｃｏｗ

山东省聊城市地处鲁西平原，有着丰富的黄牛资源，鲁西黄牛体躯高大，繁殖力较强，母牛一般８～１０月龄即可配种怀胎，终生可产犊７～１０头，产仔率较高；其前躯发育好，肌肉发达，体质结实，结构匀称，适应性强，耐粗饲，饲养成本较低，是高产奶牛胚胎移植的理想受体。鲁西黄牛多为小规模饲养和散养，同期处理技术较难适用，因此在聊城市周边乡镇分设四个移植站，以农村自然的黄牛为受体，利用高产奶牛性控胚胎进行了大规模的胚胎移植，这对提高我国奶牛质量，增加良种奶牛的数量，促进我国奶牛产业化发展具有积极意义，同时具有较高的推广应用价值。

１ 材料与方法

１．１ 高产奶牛性控雌性冷冻胚胎

由美国向中公司提供。选用年产奶量８ ０００ ｋｇ以上母牛卵母细胞经过体外培养，采用性控技术受精发育而成的７日龄冷冻胚胎。

１．１．１ 主要仪器 玻璃针、吸胚管、培养皿、过滤器、移植枪、四孔板、加热板、液氮罐、显微镜、酒精灯等。

１．１．２ 胚胎解冻 解冻过程需在实验室内无菌操作，按说明书要求进行。美国向中公司的冻胚为颗粒胚胎，每粒有小米粒大小，内有４枚胚胎，所需解冻液、基础液、漂洗液、移植液均由该公司提供。步骤为：从液氮罐中取出颗粒胚胎直接放入解冻液，时间为３５ ｓ以内；将胚胎从解冻液中取出放入基础液，时间为５ ｍｉｎ；然后将胚胎取出放入漂洗液，３～５ ｍｉｎ；最后将胚胎放入移植液，０～２ ｈ。

１．１．３ 胚胎的检查 发育正常的胚胎其透明带基本呈圆形，卵裂球均匀而紧凑，无渗出细胞；卵裂球分散或变性后一般不能用于移植。经检查合格的胚胎达到Ａ、Ｂ级，备用。

１．２ 受体母牛的准备

１．２．１ 受体母牛的选择 选用聊城市散养的鲁西黄牛或杂交牛，要求身体健康，无结核、布病等疫病，年龄在１．５岁以上，１０岁以下，有正常的繁殖能力和周期，体型大，体质健壮，自然。

１．２．２ 受体母牛的鉴定 技术人员对母黄牛进行稳栏鉴定。

１．３ 胚胎的移植

１．３．１ 受体牛的保定和消毒 经稳栏鉴定合格的母牛，鉴定当天为０ ｄ，到第７天时进行胚胎移植。将受体牛站立保定于保定架内，用温水和肥皂水清洗外，擦干后用消毒液冲洗。检查受体母牛排卵侧黄体发育情况，经检查黄体达到Ａ级或Ｂ级的为合格受体牛。为了使受体牛在移植过程中保持安静，可用２％普鲁卡因或利多卡因进行荐尾部硬膜腔麻醉［１］。

１．３．２ 输入胚胎 将解冻后检查合格的胚胎装入移植枪，移植枪通过直肠把握法送入子宫角小弯处，随后将胚胎推入。胚胎输入过程越短越好，一般操作时间不应超过１０ ｍｉｎ，要做到轻、稳、快，防止用力不当损伤子宫造成感染。

１．３．３ 受体母牛胚胎移植后的观察 胚胎移植后要注意受体母牛的健康状况，同时密切关注其在下一个周期是否。出现说明尚未受胎，移植失败，需要重新移植；移植后２个月不返情，６０～８０ ｄ做直肠孕检确定是否准胎。

２ 结果

２．１ 移植准胎率及性控比例结果

共移植受体牛５ ５１６头，６０～８０ ｄ直肠孕检怀孕的有２ ２２８头，移植准胎率为４０．３９％（表1）；共繁殖奶牛犊牛１ ３４６头，其中母牛１ ２７９头，公牛６７头，胚胎性别控制率为９５．０２％。其中许营、李海务、沙镇、高集四个移植站的移植准胎率分别为３８．５７％、４０．７３％、４２．３６％、４９．４７％，高集与许营站之间差异极显著（Ｐ＜０．０１）。不同移植站点技术人员不同，说明技术人员的操作水平对准胎率有很大的影响。

２．２ 移植季节对准胎率的影响

以自然的黄牛为受体移植高产奶牛胚胎，主要在每年春、秋两季进行。由表２可知，春、秋季的移植准胎率分别为３６．９３％、４３．5３％，秋季明显高于春季，差异极显著（Ｐ＜０．０１）。

２．３ 不同侧卵巢排卵对准胎率的影响

由表3可知，移植的５ ５１６头受体牛中，右侧卵巢排卵的为３ ６１８头，占总数的６５．５９％，左侧排卵的为１ ８９８头，占总数的３４．４１％，右侧比左侧排卵的机率高近１倍，左侧与右侧卵巢排卵移植准胎率分别为３５．１４％、４３．１５％，右侧卵巢排卵移植准胎率显著高于左侧，差异极显著（Ｐ＜０．０１）。

２．４ 黄体不同发育程度对准胎率的影响

采用直肠触摸法判断黄体发育情况，把黄体发育分为３级（即Ａ、Ｂ、Ｃ级），达到Ｂ级以上方能输胚，Ｃ＋以上勉强输胚，Ｃ级以下放弃输胚［２］。移植的５ ５１６头受体牛中，黄体发育达到Ｂ级的为最多，占７９．３９％，移植准胎率也最高。由表４可知，Ａ级、Ｂ级、Ｃ级的移植准胎率分别为３９．１６％、４１．７０％、３３．４２％，分析表明，Ａ级与Ｂ级移植准胎率差异不显著（Ｐ＞０．０５），Ｂ级与Ｃ级移植准胎率差异极显著（Ｐ＜０．０１）。

２．５ 移植双胚与单胚对准胎率的影响

移植过程中，由于受体牛的不确定性，而胚胎解冻后又无条件重新冷冻，因此，在移植过程中对受体牛输入了部分双胚。由表5可见，移植双胚与单胚的受体牛准胎率分别为３８．２４％、４０．７３％，差异不显著（Ｐ＞０．０５）。

３ 讨论

体外胚胎移植研究是近年来被关注的热点，我国仅在移植成功方面有报道［３］，但一般移植规模较小。本试验采用进口高产奶牛的雌性冷冻胚胎，利用本地散养自然的黄牛为受体进行规模化胚胎移植，移植准胎率达到４０．３９％，移植出生的１ ３４６头犊牛中，母牛１ ２７９头，公牛６７头，胚胎性别控制率为９５．０２％，达到了性控目的。

移植过程中，技术人员的操作水平对准胎率有很大影响。移植过程包括３个阶段：①胚胎解冻。不同解冻人员的操作不尽相同，从而影响到胚胎质量；另一方面解冻人员对合格胚胎认识不同，同一胚胎有人认为合格可以装枪，有人则认为不合格不能装枪，结果造成胚胎在装枪时质量有差别，进而影响到移植准胎率。②稳栏鉴定。不同技术人员对稳栏的理解不同，影响输胚时间的确定，从而影响移植准胎率。③输胚。输胚人员的技术操作对准胎率的影响表现在四个方面：对受体牛排卵后所形成的黄体判定是否准确；胚胎是否送到所要求的准确部位；输胚过程中是否对子宫造成损伤以及损伤程度；对受体牛的外消毒清洗是否严格。

春、秋季的移植准胎率不同，秋季明显高于春季，分析其原因，受体牛虽然在春季有明显的表现，但母牛经过较长时间的冬季，饲料匮乏，饲料中营养物质含量低，大多数母牛营养状况不良，特别是蛋白质、矿物质和维生素等营养素不足。同时，春季外界气温较低，气候多变，也对胚胎移植工作带来不利因素，影响了准胎率的提高；而秋季受体牛的营养状况相对较好，气候也比较平稳，从而移植成功率高。

右侧卵巢排卵移植准胎率显著高于左侧，表明右侧卵巢较左侧卵巢活跃［４，５］。与正常情况下黄牛自然大多为右侧排卵的观点一致。

黄体发育程度对移植准胎率有一定影响。试验结果表明，只要功能黄体发育达到Ｂ级以上，就能进行正常胚胎移植；反之移植准胎率可能偏低，不利于移植生产。

移植双胚与单胚的受体牛准胎率分别为３８．２４％和４０．７３％，差异不显著。分析认为，牛是单胎动物，自然状态下的双胎率很低，人为移植双胚影响了牛正常的生理状态，反而使准胎率受到影响。

本研究胚胎移植规模之大，在国内还未见报道。总的看来，利用本地散养、自然的黄牛为受体进行规模化移植是可行的，适合我国黄牛存栏多、饲养分散的基本国情，为充分利用我国黄牛资源生产纯种高产奶牛、增加高产奶牛的数量及提高质量、解决国民对牛奶的需求展现了良好的市场前景。

参考文献：

［１］ 江 成，徐光勇， 王 芸， 等． 奶牛性别控制胚胎移植研究报告［Ｊ］． 当代畜牧，２００７（２）：３８－４０．

［２］ 邱长兴，王 芸， 江 成． 影响黄牛移植奶牛胚胎准胎率的因素［Ｊ］．当代畜牧，２００７（１１）：４２－４４．

［３］ 朱化彬，敖 红， 刘云海， 等． 牛活体采集卵母细胞技术的研究［Ｊ］．中国畜牧，２００１，３７（２）：２８－２９．

［４］ 张俊功，仲跻峰，王文英，等．引进良种肉牛冻胚规模移植技术研究［Ｊ］．畜牧兽医学报，２００１，３２（４）：２８９－２９４．

［５］ 胡松廷．肉牛生产学［Ｍ］．济南：山东大学出版社，１９９３．１００－１０１．