荷叶醇提物对脑缺血再灌注抗氧化作用的实验研究
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摘要：目的 研究荷叶醇提物对脑缺血再灌注小鼠的抗氧化作用及机制。方法 50只昆明种小鼠分为5组，即模型组，假手术组，给药组分为荷叶醇提物30，60，120 mg／kg 3组。灌胃给药，每日1次，连续5d，模型对照组和假手术组给予等体积生理盐水。测定血清过氧化氢酶活性，HE染色观察脑组织病理形态学变化。果 模型组与假手术组比较，缺血再灌注后动物脑组织中过氧化氢酶(CAT)活性降低，给药组使用荷叶醇提物后，CAT活性较模型组提高，但仍低于假手术组。论 荷叶醇提物能减轻小鼠脑缺血的再灌注损伤。
关键词：荷叶醇提物；脑缺血再灌注；过氧化氢酶
中图分类号：R743.31 文献标识码：A 文章编号：1672-979X(2012)01-0029-03
荷叶是睡莲植物莲的干燥叶，含有多种生物碱和黄酮类化合物。研究显示，荷叶中的生物碱和黄酮类化合物具有降血脂、抑制胆固醇、抗有丝分裂、抑菌和止痉挛、抗氧化等活性。本实验研究荷叶醇提物对脑缺血再灌注小鼠的抗氧化作用，为进一步开发和利用荷叶这一中药资源提供理论依据。
1.仪器与材料
1.1仪器
FC104电子天平(上海恒平)；XMTB型水浴锅(北京长风)；RE-52A型旋转蒸发仪(上海亚荣)；KQ-600型数控超声波清洗器(昆山超声仪器公司)；S-5型紫外可见分光光度计(上海棱光)；超速冷冻离心机(上海安亭)；磁力加热搅拌器(金坛新航)；光学显微镜(日本OLYMPUs)。
1.2受试物及试剂
1.2.1受试物荷叶(泰安永春堂药店)。
1.2.2试剂过氧化氢酶(CAT)测试盒(南京建成)。
1.3动物
昆明种小鼠50只，雌雄兼用，体重20+2g。
2.方法
2.1荷叶提取物的制备
准确称取一定质量的荷叶粉末(过20目筛)，加入40倍的70％乙醇溶液，室温下浸泡30 min，用500kW频率的超声(超声温度35℃)提取40 min，旋转蒸发仪回收乙醇，蒸干，得浸膏。
2.2动物分组及给药
随机将50只小鼠分为5组，每组10只，即模型组，假手术组，给药组分为荷叶醇提物30，60，120mg／kg 3组。灌胃给药，每日1次，连续5d，模型组和假手术组给予等体积生理盐水。
2.3脑缺血再灌注模型制备
小鼠称重，腹腔注射10％水合氯醛(每10 g体重0.04 mL)麻醉，仰卧固定，切开颈部皮肤，分离两侧颈总动脉，缝合线牵拉，阻断血流，每牵拉10 min松开10 min，反复3次后缝合颈部皮肤，不再给药，正常饲养，假手术组只分离两侧颈总动脉不阻断血流。
2.4血液生化指标测定
48 h后摘眼球取血，室温静置1-2 h，3000 r／min离心10 min，取血清，按试剂盒说明测定过氧化氢酶活性。测定方法：用蒸馏水将20倍浓缩洗涤液稀释成原倍洗涤液。分别设置标准品孔、待测样本孔和空白对照孔，记录各孔位置，标准品孔加入标准品50μL，；待测样本孔先加入待测样本10μL，再加样本稀释液40 μL(即样本稀释5倍)；空白对照孔不加。37℃水浴锅或恒温箱保温30 min。洗板后，每孔加入酶标工作液50μL，空白对照孔不加。37℃水浴锅或恒温箱温育30 min，洗板，显色。以空白孔调零，终止后15 min内，450 nm波长测量各孔吸光度值(A)。
根据标准品浓度及对应的A值，计算标准曲线的直线回归方程，再根据样本的A值，计算对应的样品浓度。最终浓度为实际测定浓度乘以稀释倍数。
2.5取材
眼球取血后，用4％多聚甲醛心脏灌注15 min，取脑组织冠状切面4 mm，4％多聚甲醛固定6 h，蔗糖浸泡至沉底，常规包埋，冷冻切片，片厚5岫。
2.6HE(苏木精-伊红)染色
每个标本取10张，粘于多聚赖氨酸处理后的切片上，切片入苏木精染液5 min，盐酸酒精分色15 s，40℃自来水返蓝，伊红3 min，常规脱水透明封片，HE染色观察鼠脑组织构。取皮层典型视野拍照。
2.7统计学处理
采用SPSS12.0统计软件进行单因素方差分析，P
3.果
3.1CAT测试果
与假手术组比较，模型组CAT明显降低(P
3.2脑组织病理形态学变化
假手术组：细胞形态正常，神经细胞间质内未见水肿，未见病理形态改变(图1)；模型组：神经细胞数明显下降，排列散乱，神经细胞外间隙增宽，细胞严重水肿，细胞核正常构破坏，周围有空泡样改变(图2)；给药组：神经细胞水肿较模型组减轻，周围组织构较模型组清晰(图3、图4)。
4.讨论
4.1缺血再灌注损伤
缺血性脑血管疾病(ICVD)严重危害人类健康，具有发病率、致残率和死亡率高等特点，是中老年人致死和致残的主要疾病。研究缺血性脑血管病的发病机制及寻找有效的防治药物具有重要的学术价值和社会意义。现代医学研究认为，缺血可致脑损伤，恢复血供后还可导致进一步损伤，即缺血再灌注损伤。脑缺血再灌注损伤是大多数缺血性脑血管疾病的主要病理生理过程。为此，采用反复夹闭颈总动脉法制作脑缺血再灌注模型，观察荷叶醇提物的保护作用。实验果表明，荷叶醇提物能减轻脑缺血再灌注小鼠的病理组织损伤，具有明显的脑保护作用。
正常情况下，人体内自由基不断产生，又不断清除。脑缺氧时，物质代谢中三羧酸循环障碍，线粒体不能提供足够的电子将氢还原成水，果氧自由基生成增多，自由基上活跃电子与多种生物大分子发生反应，导致大分子变性失活以及脂质过氧化反应，造成生物膜损伤，膜通透性增强，引起钙依赖性蛋白水解酶活性增强，促使黄嘌呤脱氢酶转变为黄嘌呤氧化酶，自由基进一步增加，引起恶性循环。同时引起机体内存在的氧化，抗氧化系统失衡，导致自由基在体内大量堆积。
寻找有效的自由基清除剂，保护缺血半暗带内神经元免受进一步损害及促进病变恢复是实施脑保护治疗、改善缺血性脑损伤预后的重要措施之一。CAT是机体内重要的氧自由基清除剂，对脑缺血再灌注损伤有保护作用。因此，通过测定CAT可反映自由基损伤脑组织的情况。实验果表明，荷叶醇提物能明显提高CAT活性，具有抗自由基损伤的作用，这可能是荷叶醇提物抗脑缺血损伤的机制之一。
4.2荷叶醇提物提高CAT活性
羟自由基(OH)是化学性质最活泼的活性氧，几乎与细胞内的每一类有机物如糖、氨基酸、磷酸、核苷酸和有机酸等都能反应，并且有非常高的速度常数，因此其破坏性极强。但它可以被过氧化氢酶分解，因而测定过氧化氢酶的高低就有其重要意义。
本实验果显示，模型组血清中CAT活性较假手术组降低，表明缺血导致脑组织内抗氧化体系的抗氧化能力降低。给药组使用荷叶醇提物后，减少了上述指标的下降程度，说明荷叶醇提物能提高脑组织的抗氧化能力，有助于阻止脑缺氧损伤发生。但给药组CAT活性仍低于假手术组，未能恢复至正常水平。