AG490对大鼠创伤性脑损伤急性期小胶质细胞激活的影响

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小胶质细胞是中枢神经系统的免疫防御系统的主要介质［1］，是创伤性脑损伤后炎症反应不可缺少的部分［2-3］。在各种创伤、感染等病理状态下，小胶质细胞被激活，释放促炎细胞因子如白细胞介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）诱导炎症反应［4］。CDllb是实验研究中鉴定小胶质细胞的主要表面抗原物质［5］，静息状态下的小胶质细胞表面抗原CDllb极少表达，活化后其表达明显升高。ag490是一种人工合成的苯亚甲基丙二腈的脂类衍生物，是JAK激酶/信号转导和转录激活因子（janus kinase/signal transducer and activator of transcription， JAK/STAT）信号通路的抑制剂，目前尚未应用于临床［6］。近年来关于AG90的研究范围已涉及生物学的诸多方面，包括抗肿瘤研究、免疫反应机制研究等［7-10］，但其在创伤性脑损伤中的作用研究相对较少。本研究就AG90对创伤性脑损伤急性期小胶质细胞激活的影响进行探讨。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康成年雄性SD大鼠120只（体质量250～300 g），购于河北省实验动物中心，于安静、温暖、避强光的环境中饲养。随机数字表法分为对照组（n=40）、TBI组（n=40）、TBI + AG490组（n=40），每组再分为6、12、24、72 h四个亚组，每个亚组各10只动物。所有大鼠用10%水合氯醛（0.3 ml/100 g）腹腔注射麻醉后，剪去头部毛发并固定，常规消毒铺巾，正中矢状位切开头部皮肤，剥离颅骨外膜，在左侧距离矢状缝、冠状缝各5 mm处用牙科钻钻直径4 mm的骨窗，保持硬脑膜完整，骨蜡止血。对照组仅行开窗，不予以创伤。TBI组及TBI+AG490组采用液压冲击法致伤动物，于伤后1 h进行NSS评分［11］，以确保各组有相似损伤程度。TBI+AG490组大鼠于伤后1 h腹腔注射AG490 5 mg/kg，对照组和TBI组大鼠给予等渗盐水腹腔注射5 ml/kg。于规定时间处死动物，各亚组随机取5只动物，切取伤灶周围脑组织用于CD11b检测及组织病理学检查；5只用于干湿质量法检测脑组织含水量。

1.2 主要试剂及仪器

PE-ANTI-RAT CD11b（美国BioLegend公司），AG490（美国ALEXIS BIOMOL公司），流式细胞仪（美国Beckman Coulter公司），Olympuscx21光学显微镜（日本Olympus公司），LeicaRM2125轮转石蜡切片机（德国Leica公司）。

1.3 小胶质细胞表面抗原CD11b表达测定

按以下步骤处理：取脑组织约1 g于平皿中，加入PBS缓冲液，将平皿置于冰水混合物中，仔细剥除脑组织表面的脑膜及血管，用眼科剪将组织剪至匀浆状，用20 ml注射器吸取组织匀浆，用100目细胞筛过滤到试管内，再经300目细胞筛过滤掉细胞团块，制备成单细胞悬液；1000 r/min离心5 min；弃上清液，用振荡器使细胞分散，用100 μl PBS缓冲液重悬；每个样品收集2×106细胞；1000 r/min离心5 min；加一抗10 μl，4 ℃孵育30 min，1000 r/min离心5 min；去上清液，加PBS缓冲液定容至500 μl；上机检测。上述过程均同时设有阴性对照（不加入任何抗体）。

1.4 脑含水量测定实验

处死大鼠后开颅经大脑中线切开，去掉嗅叶与小脑，滤纸吸掉脑组织表面水分，电子分析天平称量伤侧脑组织湿质量。称湿质量后，于

70 ℃恒温干燥箱中36 h烘干至恒重，称量获得干质量。根据Ellit公式计算脑含水量：脑水含量（%）=（湿质量-干质量）/湿质量×100

1.5 组织病理学实验

取脑组织于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，再经脱水、透明、包埋，在石蜡切片机上进行5 μm连续切片，展片后用载玻片捞取切片烤干，然后按照以下步骤进行：石蜡切片常规脱蜡入水；自来水冲洗5 min；苏木精染色10 min；自来水冲洗1 min；1%盐酸酒精分化30 s；自来水冲洗1 min；伊红染色30 s；自来水冲洗1 min；常规脱水；透明、封片；光学显微镜观察。

1.6 统计学方法

采用SPSS 13.0软件包分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多样本均数比较采用单因素方差分析（ANOVA）统计，组间比较采用LSD-t检验。以P

2 结果

2.1 流式细胞术检测CD11b表达

TBI组脑组织CD11b表达在伤后6 h即开始升高，在12 h达（30.7±1.39）%，72 h仍处于较高水平，与对照组相比明显升高，差异具有统计学意义（P

2.2 脑含水量测定

TBI组脑组织含水量在伤后6 h即开始升高，在24 h达（89.46±9.56）%的高水平状态，72 h时仍处于较高水平，明显高于假手术组，差异具有统计学意义（P

2.3 组织病理学实验

HE染色后可见TBI组及TBI+AG490组胶质细胞均发生肿胀，但TBI+AG490组胶质细胞肿胀程度低于TBI组。见图1。

3 讨论

创伤性脑损伤（traumatic brain injury， TBI）可分为原发性脑损伤和继发性脑损伤。继发性脑损伤是在复杂的细胞凋亡机制和组织损伤机制的相互作用下导致的涉及生物化学、分子学和生理学事件，往往引起广泛的神经功能障碍和神经功能的丧失［12］。其机制包括谷氨酸的兴奋性毒性，血脑屏障的破坏，继发性出血和缺血，线粒体功能障碍，细胞凋亡、坏死以及炎症反应等［13-14］。继发性脑损伤在创伤性脑损伤后几分钟内开始，可能会持续几天、几周甚至几个月，逐步导致神经功能恶化。本研究通过检测大鼠创伤性脑损伤后小胶质细胞表面抗原CD11b的表达，发现应用AG490后，可以下调小胶质细胞表面抗原CD11b的表达，同时对创伤性脑损伤后大鼠脑组织进行病理组织学观察，发现应用AG490后小胶质细胞肿胀程度明显减轻，说明AG490能够抑制小胶质细胞的激活，减轻创伤性脑损伤急性期炎症反应；同时笔者通过脑含水量实验，发现应用AG490可以降低脑组织含水量，减轻创伤性脑损伤后脑水肿程度。

小胶质细胞约占成人中枢神经系统细胞总数的10%，属于单核吞噬细胞系，是正常中枢神经系统中最有代表性的免疫细胞［15］。它是动态活性细胞，监测中枢神经系统中的有毒物质和有害过程［16］，对细胞外的各种信号产生反应，并通过吞噬作用清理细胞碎片和有毒物质，从而维持中枢神经系统正常的细胞的稳态。在正常生理情况下，小胶质细胞处于静息状态 ［17］，维持神经元的存活，促进神经元生长、分化；病理情况下，小胶质细胞被激活，进入活化状态，细胞形态和行为发生了巨大变化［18］。此时，小胶质细胞出现细胞增殖、迁移、吞噬，抗原提呈功能的上调，天然免疫细胞表面受体的表达上调以及炎症介质如TNF-α、IL-1β的分泌，蛋白酶、活性氧及氮中间物的产生［19-20］，这些炎症介质在损伤和各种免疫刺激下可以导致神经元的功能障碍和细胞死亡［21-22］。

小胶质细胞适度活化是中枢神经系统对外界有害因素的正常反应，活化后小胶质细胞可以迁移到损伤区域，不断增殖，吞噬和降解微生物、死亡细胞及其他碎片，促进组织恢复［23］。但是小胶质细胞的过度活化导致各种炎症因子的过度表达，进而产生严重的炎症反应，导致神经元损伤程度进一步加重。

有研究证明凝血酶等刺激物可以通过JAK/STAT通路激活小胶质细胞，并产生相关炎性细胞因子［24］。JAK/STAT途径是近年来新发现的一条信号转导途径，该途径广泛参与细胞的增殖、分化以及免疫调节等过程，是众多细胞因子信号转导的重要途径［25］。本研究使用的干预剂AG490，是JAK/STAT通路的特异性抑制剂。

本研究显示创伤性脑损伤后小胶质细胞表面抗原CD11b表达在伤后早期（伤后6 h）开始升高，并于伤后24 h达高峰，伤后72 h仍处于较高水平，与对照组相比差异具有统计学意义；说明小胶质细胞在伤后早期就开始激活，并在较长时间内处于活化状态，可能参与了继发性脑损伤的炎症反应过程；给予AG490干预后，CD11b表达与对照组相比仍升高，变化趋势与TBI组表现一致，但总体升高水平低于TBI组，表明AG490可减轻创伤性脑损伤后小胶质细胞激活程度。

创伤性脑损伤后另一主要表现为创伤后局部或弥漫性的脑水肿［26］，脑水肿可进一步引起神经细胞变性、坏死，是创伤性脑损伤后病情加重的主要原因之一，如何有效控制脑水肿的形成和进展日益受到关注［27-28］。脑水肿的发生机制复杂，有研究显示与脑损伤后的炎症反应有一定的关系［29］。笔者推测JAK/STAT途径可能参与了脑水肿的发生、发展过程，而本次实验结果显示，脑组织含水量在创伤性脑损伤早期（伤后6 h）即开始升高，并在伤后24 h达到高峰，在伤后72 h仍处于高水平状态，表明创伤性脑损伤后脑水肿程度升高；给予AG490干预后，脑组织含水量仍升高，变化趋势与TBI组表现一致，但总体升高水平低于TBI组，表明AG490可减轻创伤性脑损伤后脑水肿程度。

本研究显示在创伤性脑损伤急性期应用AG490可以减轻小胶质细胞的激活，减轻急性期脑组织水肿状态，笔者推测这可能与JAK/STAT通路有关，但确切机制尚待后续研究。同时抑制小胶质细胞的激活对创伤性脑损伤远期预后的影响无法推测，这些问题将是接下来的研究方向及目标。

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（收稿日期：2012-10-20）

DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2013.03.010

基金项目：山东省自然科学基金（ZR2011HM008）

作者单位：261000 山东省潍坊，潍坊医学院（曹健锋）；潍坊医学院附属医院神经外科（季泰令、曾现伟、杨斌、李瑜、潘顺、张波）；潍坊医学院附属医院心内科（杜爱玲）；济宁市金乡县人民医院神经外科（张兴光）；

通信作者：杜爱玲，Email：.cn

中华急诊医学杂志2013年3月第22卷第3期Chin J Emerg Med，March 2013，Vol.22，No.3

P272-P275