神经干细胞与促红细胞生成素在脊髓损伤中的应用与进展
开篇：润墨网以专业的文秘视角，为您筛选了一篇神经干细胞与促红细胞生成素在脊髓损伤中的应用与进展范文，如需获取更多写作素材，在线客服老师一对一协助。欢迎您的阅读与分享！
[摘要] 脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）是由多种损伤因素引起的感觉和运动障碍，这些损伤因素包括：创伤、缺血、医源性损伤等，尽管各国研究者在其治疗方面做了很多努力，但脊髓损伤的治疗仍然是世界性的难题，目前还没有一种安全、有效的治疗方法。本文就神经干细胞和促红细胞生成素在脊髓损伤中的应用和研究进展做一综述，以便为临床治疗脊髓损伤提供新的思路和方法。
[关键词] 脊髓损伤；神经干细胞；细胞移植；促红细胞生成素
[中图分类号] R394.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）07（b）-0019-03
脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）是由多种损伤因素引起的感觉和运动障碍，其治疗仍是世界性难题。为此，各国科学家都做了不懈的努力，不断有新技术、新方法问世。其中，干细胞移植技术就是其中一项。目前，已有大量的动物实验证实干细胞移植技术是治疗SCI的有效方法，其机制可能与其释放多种神经递质、促进神经再生等有关，但其具体作用机制还有待于进一步研究[1]。目前，应用于SCI治疗研究的细胞主要有：神经干细胞（neural stem cells，NSCs）、胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs，简称ES或EK细胞）、骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMscs）、诱导性多功能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）、脐血干细胞、非干细胞，如嗅鞘细胞（olfactory ensheathing cells，OECs）、施万细胞（Schwann cells）等[2-3]。由于NSCs自身所具有的独特的优势，如：具有较高的增殖和自我更新潜能；多向分化潜能；低免疫原性等，而成为SCI较理想的移植材料[4]。
促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）产生于成人肾和胎儿肝脏，是一种由165个氨基酸残基组成的糖蛋白。过去，人们一直认为EPO只是一种作用于造血细胞的内分泌激素。但是，随着人们对EPO研究的深入，EPO已被证实是一种新型的组织保护因子，具有神经营养和神经保护作用[5]。
1 NSCs概述
1.1 NSCs生物学特性
90年代初，Reynolds等[6]从成年小鼠脑纹状体中分离出能在体外不断分裂增殖、具有多种分化潜能的细胞群，正式提出了“NSCs”的概念。目前得到普遍认可的NSCs的概念为：NSCs指具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力，能自我更新并能提供大量脑组织细胞的细胞群。其生物学特性有5方面：①趋化性：NSCs的增殖、分化和迁移与细胞外基质（ECM）有着非常密切的关系；②归巢性：NSCs在移植后，有着向着其起源部位，或功能及解剖区域的特殊趋化能力；③迁移性：NSCs移植后，其细胞的密度从注射区向周围逐渐减少；研究发现[7]，鼠脑内新产生的神经干细胞在迁移的过程中需要通过星型胶质细胞的间隙，此时干细胞会分泌一种特殊的蛋白质—“SLIT”，受到“SLIT”刺激后，星形胶质细胞会将自身凸起收回，为NSCs让路，从而使NSCs得以在脑内移动；④分化性：NSCs可以分化为神经系统的各种细胞，而且神经系统损伤区域内局部的微环境影响移植后NSCs的分化；⑤抗原性：NSCs是未分化的原始细胞，不表达成熟的细胞抗原，具有低免疫源性。
1.2 NSCs来源[8]
目前主要有：①胚胎脑组织来源的干细胞和胚胎干细胞诱导分化得到的NSCs；②由胚胎或成年哺乳动物中枢神经系统分离得到的NSCs，包括从出生到成年脑组织的广泛区域；③源于肿瘤组织或转基因永生化的NSCs，永生化的NSCs可携带目的基因，这给神经系统疾病的治疗带来了新的希望；④神经嵴细胞：该种细胞可以自我更新，能够分化形成各种细胞类型，包括NSCs，有很大的分化潜能；⑤原代细胞培养：指从脑内分离出NSCs，在合适的体外环境下培养，其细胞可以直接应用于NSCs的移植，其优点是能够和损伤部位的其他神经细胞整合，替换损伤的神经细胞，并且可以作为基因移植的最佳载体细胞；⑥iPSCs来源的NSCs：最近构建的iPSCs可以诱导分化为NSCs，而且可以战胜NSCs来源不足的问题，是一个很有发展前景的干细胞[9]；目前国内基础研究应用的NSCs多数来源于胚胎动物脑组织、动物胚胎干细胞和人胚胎干细胞。目前临床上应用治疗SCI的NSCs，大多应用人脐血来源的NSCs。
1.3 NSCs的分离、培养[10-12]
研究发现，在成年哺乳动物脑中有两个NSCs聚集区：侧脑室下区（subventricular zone，SVZ）和海马齿状回（subgranular zone，SGZ）；此外，在成年鼠前脑的嗅球中也发现有较多的NSCs聚集，且能不断生成“谷氨酸能中间神经元”。目前，体外分离培养NSCs的经典方法是：应用机械法或酶消化法分离组织，以便获取单个细胞，用含高浓度有丝分裂原如碱性成纤维细胞生长因子（bFGF/FGF-2）和（或）表皮生长因子（EGF）的无血培养基进行原代和传代培养；该法是体外获得和扩增NSCs的主要方法，获得的细胞生物性状接近于体内的细胞。NSCs体外培养方法按生长方式分为悬浮神经球法和贴壁培养法。1992年，Reynolds等[13]首先应用悬浮培养神经球法（neurosphere assay，NSA）创立了NSCs的体外培养方法，由于该方法简单、严格按照标准程序操作、重现性好等原因，已成为分离扩增NSCs最常用的方法。在体外，NSCs不仅能以悬浮生长方式扩增，也能以贴壁生长方式扩增，与悬浮培养法相比，贴壁培养法更有利于进行细胞形态学的观察、获取大量同质化的细胞，但也存在一定的局限性。
1.4 NSCs移植的最佳时间
SCI后，损伤局部以及机体本身的内环境都在不断的变化，但损伤局部以及机体本身的内环境又对移植的NSCs有很重要的影响，所以移植时间的选择对于移植细胞的存活及其分化是非常重要的。到目前为止，关于NSCs移植的最佳时间的选择还未统一。SCI后，受损的脊髓组织在原发性损伤的基础上出现继发性损伤，并在损伤后的4 h左右表现的最为明显。随后几天，损伤组织出现大片的坏死，胶质细胞活化、增生；这期间，都不利于NSCs的存活、分化。SCI后12 d左右，损伤局部出现囊肿、胶质瘢痕形成，脊髓组织的完整性被极大地破坏，也不利于移植的NSCs发挥作用。实验和临床研究表明，SCI后1、2周可考虑作为进行NSCs移植治疗的最佳时间。Okano等[14]研究发现，SCI后移植的最佳时间在损伤后的9 d左右，此时的内环境比较适合移植细胞的存活、分化以及发挥其修复SCI的作用。梁袁昕等[15]研究发现，SCI后一周进行细胞移植效果最好。目前，国内外学者对于SCI后NSCs移植的最佳时间还存在较大争议。而且，现在的大部分研究还处在动物实验阶段，由于动物和人类的差别，关于人类SCI后具体的移植时间还有待于进一步的研究。
1.5 NSCs的移植方式
NSCs移植治疗SCI的移植方式主要包括：①直接移植法：该方法是将体外制备好的NSCs多靶点直接注射到SCI的周边区域；②经静脉注入移植法：该方法是将体外制备好的NSCs注入大鼠尾静脉内，移植细胞随血液循环到达SCI部位，然后再突破血脑-脊髓屏障到达受损的脊髓组织；③经蛛网膜下腔注入移植法：该方法是指将体外制备好的NSCs注入蛛网膜下腔，移植细胞随脑脊液到达病变脊髓；④经腹膜移植：该方法是指将体外制备好的NSCs注入腹膜腔，移植细胞经腹膜到达病变脊髓；此外，还有通过载体移植技术或转基因技术，使移植细胞到达病变脊髓而发挥作用，但上述哪种移植方式更合适、有效，到目前为止，还没有定论[16]。目前，动物实验多采用直接移植法。
2 NSCs治疗SCI的可能机制
①NSCs在宿主体内的存活、迁移以及分化：NSCs移植入宿主体内后，在趋化因子的作用下，移植细胞向着SCI部位迁移，并在损伤部位分化为神经系统的各种细胞，替代受损神经细胞，重建突触联系，从而达到促进神经功能恢复的目的。孔令胜等[17]发现：在体外分离、培养出的大鼠NSCs，移植到大鼠SCI区域后可存活、迁移，并能够有效地保护SCI后的前角运动神经元，从而促进SCI大鼠的后肢运动功能恢复。②分泌神经营养因子促进轴突再生：移植的NSCs具有神经营养作用，其在SCI区域可分化产生神经元细胞和胶质细胞，这些神经细胞可以分泌多种神经营养因子，改善损伤脊髓局部的内环境，并启动再生相关基因的顺序表达，从而使损伤的轴突再生，修复损伤的神经细胞。此外移植的细胞还可以产生多种细胞外基质，填充脊髓损伤后留下的囊腔，为轴突再生提供支撑物。③替代作用：移植NSCs通过产生外源性神经元，替换损伤的神经细胞，与神经系统相整合，形成新的神经突触，重建神经元回路。④神经保护以及免疫抑制作用：移植NSCs可以减少损伤脊髓周围组织坏死，抑制炎症、胶质瘢痕形成、细胞凋亡、细胞再损伤。⑤移植的NSCs可以分化产生少突胶质细胞，促进新生的神经纤维和残存脱髓鞘的神经纤维髓鞘化，以恢复神经结构的完整性，促进神经功能的恢复[18]。
3 EPO治疗SCI的可能作用机制
3.1 促进NSCs的增殖与分化，促进神经再生
SCI后，EPO能够长期直接作用于NSCs，诱导神经营养因子的表达，促进受损处神经再生。研究发现，在实验性自身免疫性脑脊髓炎模型中，重组人促红细胞生成素（rhEPO）能够增强少突胶质细胞的增殖和髓鞘的再生，从而促进SCI后神经功能的恢复。此外，EPO还可以促进神经细胞轴突再生，调节机体血管痉挛，刺激新生血管形成，从而为SCI的修复提供良好的微环境，对脊髓功能的恢复非常有益。
3.2 减少神经细胞的凋亡
EPO可以通过阻断炎症坏死和细胞凋亡而保护神经细胞，但到目前为止，有关EPO减少神经细胞凋亡的机制还不是十分清楚。研究发现，在体外，EPO可以保护神经元免受缺氧和各种其他介质，包括兴奋性毒性介质、葡萄糖缺乏诱导的细胞死亡。在体内脊髓神经根挤压伤后，EPO能够立即发挥防止脊髓背根神经节细胞凋亡的作用；在大鼠脊髓压迫模型中，也发现了EPO的细胞保护作用。研究表明[19-20]，炎症细胞的缺失可能导致凋亡过程和caspase-1的抑制，而它们正好构成了SCI后部分的炎症过程。
综上所述，NSCs能分化为神经系统的各种细胞，替代变性、坏死的神经细胞，并与宿主神经系统相整合，重建受损的神经环路，恢复受损脊髓的功能。EPO可抑制SCI后的炎性反应、减少兴奋性氨基酸的产生、减少氧自由基的生成、降低NO的含量，从而为SCI后神经细胞的再生、轴突的生长提供合适的微环境。此外，NSCs和EPO具有以下共同的生理作用：促进轴突再生；抑制神经细胞凋亡；抑制SCI后的炎性反应等。
4 问题与展望
NSCs由于其本身独特的生物学特性，使其在治疗中枢神经系统性疾病方面有着非常广阔的前景。但到目前为止，对NSCs的研究尚处于动物实验阶段，将其应用于临床还有一系列的问题需要解决，如：①移植后NSCs的增殖、分化、迁移机制还没有得到明确的阐释， 对于NSCs精确的调控也还有很长的路要走；②在NSCs移植的来源选择上还未经过系统的比较；③NSCs作为转基因载体治疗神经系统疾病的疗效和安全性等问题仍需进一步观察；此外，NSCs移植的最佳时机、合适的移植方式、神经细胞移植后的成瘤性等问题还有待于进一步的研究。与此同时，EPO对SCI后治疗机制的研究也处于动物实验阶段，临床上应用个体差别较大，EPO在临床上的应用也存在许多亟待解决的问题，如EPO治疗SCI的给药时间，合适的给药剂量以及疗程，EPO的用药方式等。相信随着相关研究的深入，上述这些问题也会得到进一步的解决，SCI的治疗效果也会得到进一步的改善。
[参考文献]
[1] Tewarie RS，Hurtado A，Bartels RH，et al. Stem cell based therapies for spinal cord injury[J].J Spinal Cord Med，2009，32（2）：105-114.
[2] Vawda R，J Wilcox，MG Fehlings. Current stem cell treatments for spinal cord injury [J]. Indian J Orthop，2012，46（1）：10-18.
[3] 张寿，王琮仁.干细胞治疗脊髓损伤的研究进展[J].海南医学，2012，23（22）：1-3.
[4] 李国刚，孙涛，赵其娜，等.神经干细胞治疗脊髓损伤的研究进展[J].山东医药，2010，50（31）：113-114.
[5] Nelvys Subirós，Diana García，Rosa M，et al. Erythropoietin：still on the neuroprotection road [J]. Ther Adv Neurol Disord，2012，5（3）：161-173.
[6] Reynolds BA，Tetzlaff W，Weiss S，et al. A multipotent EGF-responsive striatal embryomic progenitor cell produces neurons and astrocytes[J].J Neurosci，1992，12（11）：4564-4574.
[7] Aguirre A，Rubio ME，Gallo V. Notch and EGFR pathway interaction regulates neural stem cell number and self-renewal[J].Nature，2010，467（7313）：323-327.
[8] 陈涛，田增民.神经干细胞来源的研究与进展[J].中国组织工程研究与临床康复，2009，13（27）：5367-5370.
[9] Lin SL. Concise Review： Deciphering the Mechanism Behind Induced Pluripotent Stem Cell Generation [J]. STEM CELLS，2011，29（11）：1645-1649.
[10] Brill MS，Ninkovic J，Winpenny E，et al. Adult generation of gluta-matergicol factory bulb interneurons[J].Nat Neurosci，2009，12（12）：1524-1533.
[11] 王霞，屈卫东.神经干细胞的分离培养方法研究进展[J].卫生研 究，2011，40（2）：256-259.
[12] 康庄，胡志强.神经干细胞培养鉴定及分化调控机制的研究进展[J].医学综述，2012，18（23）：3929-3932.
[13] Reynolds BA，Weiss S.Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of themammalian central nervous system[J].Science，1992，255（5052）：1707-1710.
[14] Okano H，Ogawa Y，Nakamura M，et al. Transplantation of neural stem cells into the spinal cord after injury[J]. Semin Cell Dev Biol，2003，14（3）：191-198.
[15] 梁袁昕，杨述华，邓兴力，等.不同时间干细胞移植对于脊髓损伤大鼠的作用[J]. 中国中医骨伤科杂志，2009，17（4）：16-18.
[16] 钱晓丹，罗春霞，朱东亚.神经干细胞移植研究进展[J].中国细胞生物学学报，2012，34（3）：212-217.
[17] 孔令胜，聂冬丽，张军臣，等.神经干细胞移植促进大鼠前角运动神经元存活及后肢运动功能恢复的实验研究[J].实用医学杂志，2009，25（20）：3402-3404.
[18] Nandoe RS，Hurtado A，Bartels RH，et al. Stem cell- based therapies for spinal cord injury [J]. J spinal cord Med，2009，32（2）：105-114.
[19] 邱双平，吴武忠，张翔.维持性血液透析患者静脉补铁与口服补铁疗效的比较[J].中外医学研究，2010，8（9）：66-67.
[20] 黄珍珍，兰雷，江洁龙.左卡尼汀联合促红素对维持性血透患者贫血治疗的临床观察[J].中外医学研究，2010，8（11）：29-30.
（收稿日期：2013-04-09 本文编辑：卫 轲）