利用同功酶研究新疆狗牙根的遗传多样性
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摘要：利用过氧化物酶同功酶（POD）、酯酶同功酶（EST）、超氧化物歧化酶（SOD）、酸性磷酸酯酶对7份新疆狗牙根材料遗传多样性進行检测，结果表明：供试材料同功酶多样性程度高，4种同功酶中，EST同功酶的多态性最高，可良好区分新疆狗牙根种内不同生态型；同功酶酶谱的聚类分析结果与外部形态并无绝对相关性。
关键词：新疆狗牙根；同工酶；电泳；遗传多样性
狗牙根为多年生草本植物，世界上分布极广，具有丰富的遗传变异，是宝贵的草坪草种质资源。新疆狗牙根具有较强的抗寒性、抗旱性、耐盐性、抗热性、抗病虫害等特性，因此，在草坪生产中受到广泛重视。为了更好利用资源，需对其遗传多样性進行研究。在检测狗牙根种质资源遗传多样性中，由于杂交、多倍体无融合生殖使植物形态特征变得模糊，同功酶作为一种稳定的遗传标记，是经济有效的方法。Dabo等用PAGE凝胶电泳法检测出不同狗牙根品系的同功酶差异性。刘建秀等用酯酶同功酶对华东地区野生狗牙根的遗传变异進行研究，发现居群内变异大于居群间变异。王赞，毛凯等对攀西地区野生狗牙根资源進行形态和同功酶水平研究，表明不同居群蛋白质图谱与地理分布和生境条件有一定关系，过氧化物酶同功酶作为遗传标记，可用于攀西地区狗牙根种以下单位亲缘关系和遗传多样性研究。对于新疆狗牙根的研究多侧重于外部形态方面。本研究拟通过4种同工酶对7份新疆狗牙根材料遗传多样性進行研究。
1.材料与方法
1.1试验地概况
试验地为新疆农业大学试验场，位于乌鲁木齐市，海拔850m，年均温度6.5℃，年极端最高温度38.8℃，年极端最低温度-41.5℃冬季有积雪，年降水量230mm，，年蒸发量2570mm。土壤冻结期11月中旬，解冻期3月中旬，无霜期150天左右。试验地前作为种植3年的牧草，土壤为荒漠灰钙土，肥力中等，有灌溉条件。
1.2试验材料及种植方法
7份供试材料分别为：新农一号狗牙根、喀什狗牙根和新农二号狗牙根，新疆农业大学选育的4份新疆狗牙根材料，即新疆狗牙根C2、新疆狗牙根C3、新疆狗牙根C4、新疆狗牙根C5，于2002年7月11日利用根茎营养繁殖体進行穴播，采用随机试验设计。
1.3试验方法
同工酶电泳参照郭尧君等的方法，同工酶染色参照何忠效、王中仁等的方法并做了相应的改动。随机抽取直立茎顶部倒数第3片叶片，每个小区取样数10个。每0.2g叶片约加700μL提取液（ddH2O），冰浴研磨，9000r/min、4℃离心机中离心15min，取上清，加入等体积的上样缓冲液（20%蔗糖+0.1%溴酚篮）并混匀，置于4℃条件下保存备用。
4种同功酶电泳均采用不连续性垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离胶的浓度为10%，浓缩胶的浓度为4%。其电极缓冲液都为Tris-甘氨酸缓冲系统（Tris），电泳时上样量均为30μL。160V恒压电泳约2.5h，当前沿指示剂距胶板底部约1cm时停止电泳，之后進行染色。
1.4数据处理
将酶谱中的酶带按照其特征和相对最大迁移率命名、分区，并将具有多态性的谱带有带的量化为1，无带的量化为0，计算新疆狗牙根材料遗传相似系数，同时对供试材料進行酶谱带数的统计及多态性研究。采用类平均法（Unweighted pairgroup method affthmetic average）对相似系数矩阵進行聚类分析，聚类结果中的树状图是根据欧式距离進行分类分析。所有数据统计由DPS v2.00统计软件完成。各酶条带的最大迁移率（Rf）：Rf=X2/X1，其中：X2——染色后酶条带的迁移距离；X1——染色后溴酚蓝指示剂的迁移距离。
2.结果与分析
2.1同功酶多态性分析
供试材料4种同功酶电泳酶谱显示出较为丰富的多态性差异（见表1）。由此可以看出，EST产生的总条带数最多，且产生的多态性条带数也最多；POD与酸性磷酸酯酶总条带数略不同，但两者的多态性条带数相同；SOD产生的总条带数和多态性条带数均最少。因此可知，4种同功酶的多态性大小为：EST>酸性磷酸酯>POD>SOD。
2.2同功酶酶谱特征分析
2.2.1过氧化物酶同功酶酶谱结构及特征分析。电泳检测表明，7份新疆狗牙根材料的POD酶谱可分为A、B 2个区（由阴极到阳极），A区每份材料都有2条强带，最大迁移率分别为3.64%、7.27%；A区除新农一号狗牙根有2条带，其余材料均有3条带。B区，迁移率12.7%位点的强带是新农二号狗牙根过氧化物酶的特征带之一；迁移率19.1%位点的谱带是新疆狗牙根C2过氧化物酶的特征带之一。
2.2.2酯酶同功酶酶谱结构及特征分析。EST酶带可明显分为A、B、C3个区（由阴极到阳极）。在A区（迁移率0.0%～12.73%）中只新疆狗牙根C2，新疆狗牙根C3分别在迁移率6.36%和12.73%两位点处呈现2条谱带，其它材料仅在迁移率12.73%有1条谱带；B区（迁移率20.0%-29.1%）中，除新疆狗牙根C2、新疆狗牙根C5外其余材料均有1条带，迁移率25.45%位点的谱带是新农二号狗牙根EST的特征带之一；迁移率29.10%位点的谱带是新疆狗牙根C2酯酶的特征带之一；C区（迁移率32.73%～38.18%）中，迁移率32.73%位点的谱带是新疆狗牙根C4酯酶的特征带之一。
2.2.3酸性磷酸酯酶同功酶酶谱结构及特征分析。电泳检测表明，7份新疆狗牙根材料的酸性磷酸酯酶同功酶酶谱可分为A、B2个区（由阴极到阳极）。A区在迁移率7.27%处，仅新农二号狗牙根、新疆狗牙根C2有1条带。B区（迁移率20.0%-31.82%）中，迁移率25.45%位点的谱带是新疆狗牙根C4酸性磷酸酯酶的特征带之一。喀什狗牙根和新疆狗牙根C2的最大迁移率明显较小，分别为2.7%，7.3%；其余材料最大迁移率均在20%-31.8%之间。
2.2.4超氧化物歧化酶同功酶酶，谱结构及特征分析。电泳检测表明，7份新疆狗牙根材料的SOD酶谱可分为A、B、C3个区（由阴极到阳极）。在A区（迁移率0.0%-6.36%）中，有1条带，是新农二号狗牙根SOD的特征带之一；在B区（迁移率21.82%～34.55%）中，新疆狗牙根C4、新疆狗牙根C5、喀什狗牙根有3条带，其余材料均有2条带。在C区中，在迁移率为60.0%处，只有新疆狗牙根C5和新农一号狗牙根有1条带。从以上分析上看，7份新疆狗牙根材料的4种同功酶谱在酶带数量（见表2）、迁移率和表达量上表现出差异，显示了其遗传上的多样性。
2.3新疆狗牙根材料同功酶谱带的聚类分析
基于4种同功酶酶谱相似系数的聚类结果见图1，在遗传相似距离2.21处将7份新疆狗牙根材料分成4类：新农一号狗牙根、新农二号狗牙根均单独为一类，新疆狗牙根C2、新疆狗牙根C4和喀什狗牙根聚为一类；新疆狗牙根C3和新疆狗牙根C5聚为一类。
新疆狗牙根C2与新疆狗牙根C4同功酶酶谱相似性强，说明这2份材料的遗传差异较小，亲缘关系较近；新疆狗牙根C3与新疆狗牙根C5同功酶酶谱相似性强，说明这2份材料的遗传差异较小，亲缘关系较近。新农一号狗牙根、新农二号狗牙根与其它供试狗牙根材料同功酶酶谱差异较大，分别单独为一类，说明与其它供试狗牙根的遗传差异较大，亲缘关系较远。
3.讨论与结论
从形态学或表型上检测遗传变异是最古老也最简便易行的方法，能够明确显示遗传多样性的外观性状，但许多形态标记的遗传表达有时不太稳定；同功酶是基因表达的产物，与形态性状相比，受环境的影响较小，分析所需材料少，试验技术简单，结果易于比较，但它是基因表达的产物，受植物生育阶段、环境条件等的影响，反映出来的遗传多样性的稳定性和准确性较DNA水平的多态性逊色一些。对7份新疆狗牙根材料生物学特性、坪用性以及环境适应性（越夏、抗病虫害、越冬率）等方面已作了相关试验研究。新疆狗牙根C3和新农一号狗牙根形态相似性强，但谱型差异较大，说明形态与同功酶谱型并无绝对相关性。新疆狗牙根C4和喀什狗牙根形态相似性强，同功酶酶谱型较相似，表现极强同源性。新疆狗牙根C5和新疆狗牙根C3外形相差较大，但同功酶酶谱型相似性强，说明尽管生态适应使狗牙根的外型发生变化，但还未涉及到控制蛋白质合成的基因位点发生变化。供试狗牙根广泛分布于新疆南北疆平原绿洲地区，形态相差较大，谱型具有多型性，但基本谱型相同，说明其遗传变异是等位基因差异造成的。4种酶中，EST同功酶的多态性最高，可良好区分新疆狗牙根种内不同生态型。同功酶是基因的产物，但终归只是基因的表现型而不是基因型。还不能真正从基因水平检测遗传多样性。因此，在用同功酶检测植物遗传多样性时，还应结合更加精确的DNA分子标记（如RAPD，RFLP，AFLP等等）共同進行，才能更完整的反映供试材料的遗传多样性。