HLA-DR、HLA-DQ分子在瘢痕疙瘩患者外周血单个核细胞中的变化
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[摘要]目的：探讨瘢痕疙瘩患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）hla-dr和hla-dq分子的含量及其基因型的变化。方法：采用免疫细胞化学方法检测10例瘢痕疙瘩患者、10例扁平瘢痕患者及10例正常人外周血单个核细胞中HLA-DR、HLA-DQ分子的含量；应用聚合酶链反应-序列特异性引物（polymerase chain reaction-sequence specific primers，PCR-SSP）方法检测60例瘢痕疙瘩患者和110例正常人外周血单个核细胞HLA-DR和HLA-DQ的基因位点。结果：①瘢痕疙瘩患者外周血单个核细胞HLA-DR、HLA-DQ分子含量的变化：瘢痕疙瘩组HLA-DR+、HLA-DQ+细胞的积分光密度（813.16±62.77，420.12±94.25）高于扁平瘢痕组（636.22±133.95，302.77±89.77）和正常人组（597.88±166.36，308.57±44.05）（P＜0.01）；②瘢痕疙瘩患者外周血单个核细胞中HLA-DR和HLA-DQ基因位点的变化：瘢痕疙瘩组HLA-DR14和HLA-DQ5位点的抗原频率（0.16，0.28）明显高于对照组（0.06，0.15）（P＜0.05），HLA-DR17和HLA-DQ8位点的抗原频率（0.02，0.03）明显低于对照组（0.13，0.15）（P＜0.05）。结论：HLA-DR和HLA-DQ分子含量在瘢痕疙瘩患者外周血单个核细胞中增高提示瘢痕疙瘩患者机体可能处于高免疫应答状态；基因型检测结果则提示HLA-DR14、HLA-DQ5可能是瘢痕疙瘩的易感基因，HLA-DR17、HLA-DQ8可能是抵抗基因。
[关键字]瘢痕疙瘩；HLA-DR；HLA-DQ
[中图分类号]R619+.9[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2008）03-04
Variation of HLA-DR、DQ molecule in the peripheral blood mononuclear cells of keloid patients
SUN Dong-jie, CHEN Dong-ming, NIE Fang-fei, LI Sheng, ZHAO Xia, BAO Wei-han
(Department of Plastic Surgery, the Third Hospital of Peking University, Beijing 100083, China)
Abstract:ObjectiveTo investigate the variation of contents and genotypes of HLA-DR、DQ molecules in the peripheral blood mononuclear cells of keloid patients. MethodsThe expression levels and distribution patterns of HLA-DR、DQ in peripheral blood mononuclear cells were determined in 10 samples of keloid, 10 samples of thin and flat scar and 10 cases of normal people with immunocytochemical staining. The gene locuses of HLA-DR、DQ in peripheral blood mononuclear cells of 60 patients with keloid and 110 normal persons were detected by using polymerase chain reaction-sequence specific primers（PCR-SSP）.Results①The variation of the HLA-DR、DQ molecules contents in the peripheral blood mononuclear cells of keloid patients: The integrated absorbance of HLA-DR+、HLA-DQ+ cells in the keloid group（813.16±62.77，420.12±94.25）was higher respectively than that of HLA-DR+、HLA-DQ+ cells in the flat scar（636.22±133.95，302.77±89.77） and normal people groups （597.88±166.36，308.57±44.05）（P＜0.01）. ②The variation of gene locuses of HLA-DR、DQ in the peripheral blood mononuclear cells of keloid patients: HLA-DR14 and HLA-DQ5 antigen frequencies were significantly higher in patients with keloid（0.16，0.28） than those in the controls（0.06，0.15）（P
Key words: Keloid;HLA-DR;HLA-DQ
皮肤瘢痕疙瘩的发生是多因素作用的结果，其中免疫因素起着至关重要的作用[1-2]。HLA-II类分子包括HLA-DR、HLA-DQ、HLA-DP，主要分布于B细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、内皮细胞和活化的T细胞表面，负责呈递外源性抗原，是免疫应答反应的关键分子[3]。本实验采用免疫细胞化学方法分析瘢痕疙瘩患者外周血单个核细胞中HLA-DR与HLA-DQ蛋白含量和分布；采用聚合酶链反应-序列特异性引物技术（PCR-SSP）检测瘢痕疙瘩患者外周血单个核细胞中HLA-DR、HLA-DQ基因位点的改变，以探讨HLA-DR、HLA-DQ在瘢痕疙瘩发病机理中的作用。
1材料和方法
1.1 材料来源：实验所用血液标本均来自北京大学第三医院成形外科瘢痕门诊。采用瘢痕疙瘩、扁平瘢痕及正常人外周血各10例用于HLA-DR、HLA-DQ蛋白检测；60例瘢痕疙瘩及110例正常人的外周血用于HLA-DR、HLA-DQ的基因检测。
1.2 实验方法
1.2.1 免疫细胞化学方法：外周血单个核细胞涂片的制备：取新鲜外周血，肝素抗凝，用RPMI-1640培养液稀释后，采用密度梯度离心法提取单个核细胞，离心涂片机涂片，直径0.8cm，丙酮固定，-20℃贮存备用。
免疫细胞化学染色：选用链霉卵白素-过氧化物酶法显示HLA-DR,HLA-DQ蛋白。I抗，鼠抗人HLA-DR、HLA-DQ单克隆抗体及HistostainTM -SP试剂盒由北京中杉金桥生物技术公司购置，DAB显色。
1.2.2 序列特异性引物多聚酶链式反应（PCR-SSP）方法：基因组DNA的提取[4]：取静脉血5ml，EDTA抗凝，用盐析法提取DNA，测定吸光度值，调整DNA浓度至50～100ng/μl。
序列特异性引物多聚酶链式反应（PCR-SSP）[5]：Biotest DRB SSP kit（德国）、DQB SSP kit（德国）PCR反应板（德国）内含有32个反应孔，第一孔为阴性对照孔，不含特异性引物，其他31孔含有特异性引物，可检测31个基因位点，31对特异性引物已由公司预先放入反应孔中。基因片段均为120～270bp。PCR反应体系：50μlPCR反应缓冲液（10mmol/L Tris-HCl pH8.3，50mmol/L KCl，2.5mmol/L MgCl2），含4种200μmol的dNTP，一对引物各为1μmol/L，1μg待扩增DNA，混合后94℃5min预变性加入Taq酶、模板DNA。PCR反应条件：94℃4min预变性，94℃10s变性，退火65℃1min，延伸72℃1min为一个循环进行扩增，共35个循环，后延伸72℃5min。
结果判定：扩增产物于2%琼脂糖凝胶中（含溴化乙锭1μg/ml）电泳后，紫外透射灯下观察结果，相应的HLA-DR、HLA-DQ等位基因电泳道中可见到清晰的DNA条带即为阳性。
1.3统计分析
1.3.1 免疫细胞化学结果统计分析：HLA-DR+、HLA-DQ+细胞的计数方法：在10×40倍光镜下，选取细胞分布均匀的区域记200个单个核细胞，分析各组阳性细胞百分率。
HLA-DR+、HLA-DQ+ 细胞的积分光密度：应用CMIAS2001B多功能彩色图像分析仪，在10×20倍数下采集图像，每张样本选取5个视野，检测瘢痕疙瘩组、扁平瘢痕组和对照组外周血HLA-DR+、HLA-DQ+单个核细胞的积分光密度。积分光密度是各个单独探测的像点密度分布的总和，即积分光密度=被测物体面积×平均光密度。用积分光密度表示HLA-DR、HLA-DQ分子的蛋白含量，P＜0.05为有显著性差异。
采用SPSS11.0统计软件进行数据处理，细胞计数和积分光密度的数据均以x±s表示，所得计量资料多组间比较行单因素方差分析，两两比较用LSD方法，P＜0.05为差异有显著性意义。
1.3.2HLA-DR、HLA-DQ基因型分析方法：瘢痕疙瘩组及正常对照组HLA-DR、HLA-DQ各基因位点的抗原频率（antigen frequency，Af）=阳性例数/检测例数，基因频率（gene frequency，Gf）=1- ；计算相对危险率（relative risk，RR），RR=瘢痕疙瘩组抗原频率/对照组抗原频率，RR＞1表示该基因位点瘢痕疙瘩组的抗原频率高于对照组，即有此基因的人患该病的危险性增高，RR
2结果
2.1 瘢痕疙瘩、扁平瘢痕和正常人外周血HLA-DR+及HLA-DQ+单个核细胞的比较：Wright-Giesa染色，光学显微镜下观察离心涂片，可见单个核细胞包括淋巴细胞，核大圆形，一侧有切迹，呈蓝紫色，胞质少，呈天蓝色；单核细胞较大，核为椭圆形或肾形，呈浅紫色，胞质灰蓝色；偶见中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞等细胞（图1）。
免疫细胞化学染色，镜下可见HLA-DR阳性和HLA-DQ阳性信号均在单个核细胞表面，着棕黄色，无棕黄色的为阴性细胞（图2）。
图1 正常人外周血单个核细胞（Wright-Giesa染色，400×）(单个核细胞包括淋巴细胞（a），核大圆形，一侧有切迹，呈蓝紫色，胞质少，呈天蓝色。单核细胞（b）较大，核为椭圆形或肾形，呈浅紫色，胞质灰蓝色)
瘢痕疙瘩组、扁平瘢痕组和正常对照组3组HLA-DR+单个核细胞数量分别为（62.82±13.0）、（59.85±13.75）和（61.05±16.37）；HLA-DQ+单个核细胞数量分别为（21.90±8.86）、（29.20±8.85）和（21.10±8.16）。统计学分析组间比较（P＞0.05）差异无显著性意义。而瘢痕疙瘩组HLA-DR+、-DQ+单个核细胞的积分光密度均高于扁平瘢痕组和正常对照组(P＜0.01)（表1）。
2.2 瘢痕疙瘩和正常人外周血HLA-DR及HLA-DQ基因型的比较：PCR-SSP结果显示正常人及瘢痕疙瘩患者HLA-DR、HLA-DQ基因分布在23个基因位点（表2），通过相对危险率（RR）评估瘢痕疙瘩与HLA-DR，-DQ基因位点的关联，结果RR＞1的基因位点包括HLA-DR1、11、13、14、15、51和DQ5、6；RR＜1的基因位点包括HLA-DR4、9、10、12、16、17、52、53和DQ2、7、8、9；RR≈1的包括HLA-DR7、8和HLA-DQ4。 经χ2检验，瘢痕疙瘩组与对照组相比HLA-DR14及HLA-DQ5的抗原频率（0.16，0.28）明显高于对照组（0.06，0.15）（P＜0.05），其RR值分别为2.62和1.83；HLA-DR17和HLA-DQ8的抗原频率（0.02，0.03）明显低于对照组（0.13，0.15）（P＜0.05），RR值分别为0.13和0.23。
3讨论
HLA-DR 和HLA-DQ 属HLA-Ⅱ类抗原, 编码它的基因群称为人类主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC） 位于第6 号染色体的短臂上，是目前已知的人体最具多态性的基因体系[3]。HLA-Ⅱ类抗原存在于抗原提呈细胞、B 淋巴细胞、单核细胞,负责外源性抗原的加工和提呈，对CD4＋T细胞具有限制作用，通过抗原肽-MHC-T细胞受体三分子复合体形式参与免疫应答[6]。树突状细胞是一种抗原呈递细胞，HLA-DR＋树突状细胞在瘢痕疙瘩组织中的增加说明瘢痕疙瘩局部处于高免疫应答状态[7-8]。与扁平瘢痕组和正常对照组相比，瘢痕疙瘩患者外周血HLA-DR＋、HLA-DQ＋单个核细胞数量虽无明显差异但HLA-DR、HLA-DQ含量增多，此结果表明，瘢痕疙瘩患者机体可能也处于一种高免疫应答状态，当有某些因素刺激时易发生机体免疫应答反应。该结果可能解释临床上常说的“瘢痕体质”，即在同样部位、同样致伤因素作用下，大部分人能正常愈合，而少部分人形成瘢痕疙瘩的现象。
早在1977年Laurentaci 等人报道白种人增生性瘢痕与HLA-B14 和HLA-Bw16 相关开始[9]，陆续有研究发现HLA-B21、-Bw35、-DR5、-DQw3 、HLA-DQ5和A血型与瘢痕疙瘩的发生有较密切的关系[10]。本实验通过PCR-SSP 方法观察发现瘢痕疙瘩的发生与HLA-DQ5及HLA-DR14呈正相关，与HLA-DR17及HLA-DQ8呈负相关。HLA-DR14、-DQ5、-DR17 和HLA-DQ8 基因位点可能是瘢痕疙瘩患者易感的单倍型。其中HLA-DR14和HLA-DQ5可能是瘢痕疙瘩的易感基因，而HLA-DR17和HLA-DQ8则可能是其抵抗基因。
与本研究比较，前期研究[11]结果显示HLA-DR14位点的相对危险率在所有基因位点中最高（2.98），但经χ2检验无显著性差异(P＞0.05)。排除计算方法问题，本实验增加了样本量，统计分析可见DR14位点相对危险率虽稍有降低（2.62），但经过χ2检验P＜0.05，差异显著。该结果说明HLA-DR14在瘢痕疙瘩发生过程中可能是一个参考的单倍型基因。
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[收稿日期]2007-12-26[修回日期]2008-03-05
注：“本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。”