广州地区汉族儿童群体肿瘤坏死因子βNcoI 位点多态性与全身反应综合征易感性的相关分析

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【摘要】目的 探讨TNFβNcoI位点多态性在广州地区汉族儿童中的分布特征,及与全身反应综合征的易感关系。方法 对481名广州汉族儿童健康个体及136例全身反应综合征患儿, 采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性法( PCR-RFLP) 对TNFβNcoI位点进行基因水平多态性分析。结果 广州地区汉族儿童群体TNFβNcoI位点有TNFB1/ TNFB1、TNFB1 /TNFB2、TNFB2/TNFB2 3种基因型,健康群体频率分别为24.74%、49.69%和25.57%，TNFB1等位基因分布频率较欧美白种人高，差异有统计学意义（P

【关键词】肿瘤坏死因子β；全身炎症反应综合征；多态性，单核苷酸；PCR-RFLP, 易感性,儿童

全身炎症反应综合征( systemic inflammatory response syndrome, SIRS)是因各种感染或非感染病因作用于机体而引起的一种难以控制的全身性瀑布式炎症反应[1]。肿瘤坏死因子β (tumor necrosis factor，TNFβ)作为前炎症因子，在炎症性疾病的发生发展中具有重要意义。研究此多态性在我国健康人群及全身炎症反应综合征（SIRS）群体中的分布特征有助于了解TNFβ与SIRS易感性的关系，全身性炎症反应的发病遗传背景，为炎性疾病在分子水平研讨发病机制奠定基础。本研究以广州汉族儿童个体为代表, 抽样调查了TNFβncoi位点多态性在健康人群及SIRS群体中的分布状况, 探讨其分布特性及与SIRS的易感性关系；并进行Hard-Weiberg平衡检验。

1. 对象和方法

1. 1 对象样本分别来自广州地区481名学龄前健康儿童体检血标本及2013年1月-6月我院136例SIRS患儿血标本。SIRS诊断依据2005年国际儿科脓毒症定义会议上制定的SIRS诊断标准，为疾病组：男性89名, 女性47名。年龄在1月-13岁间，平均年龄（35.95±3.24）月；健康组：男性295名, 女性186名。年龄在1月-14岁间,平均年龄(49.97±0.99)月；排除炎症性疾病, 体格检查及检验未见异常。所有对象均为汉族儿童, 无血缘关系。2组儿童年龄（X2=1.784 / p= 0.218）、性别（X2=0.77/p=0.38）具有可比性。本研究实施过程符合医学伦理规范要求。

1. 2 方法

1. 2. 1 外周全血基因组DNA的提取抽取受试者空腹外周静脉血1.0mL加抗凝剂EDTA 0.2～0.5mL 混匀抗凝,按QIAamp DNA Blood Mini Kit(Qiagen, Hilden, Germany) 的操做指南进行外周全血基因组DNA提取;并将抽取的DNA样本标志好后于-20℃冰箱保存供后续实验使用.

1.2.2 肿瘤坏死因子βNcoI位点基因型测定：(1)扩增TNFβ基因片段:上游引物[7]5’-CCG TGC TrC GTG CTT TGG ACT A-3’，下游引物 5’- AGA GCT GGT GGG GAC ATG TCT G-3’；PCR反应体系: Green master mix, 2×, (Promega，Madison ,USA)25μL, 上下游引物均为1.0μmol/L ,模板300～400mg,最后加纯水补至50. 0μL；按95℃预变性5 min ,然后94℃ 30s ,50 ℃ 60s ,72 ℃ 2min,共37个循环,最后72 ℃延伸5 min。扩增产物片段长度为872bp。(2)酶切反应：酶切体系: PCR 产物5μL, 10x酶切缓冲液2L, NcoI0.5U, 加水至20L,37℃恒温水浴2h,65℃15-20min终止反应。（3）确定基因型：取(10-15)μL酶切产物于20g/L 琼脂糖凝胶(0.5mg/ LEtBr)在EPS-300电泳仪(稳压稳流电泳仪，上海天能科技有限公司）中电泳(80～90V,1h ),以 DL 2000DNAMarker为分子量标准。将凝胶放置Gel Doc EQ凝胶成像系统(Bio-RAD Gel Doc XR，USA)进行摄像分析。依据电泳图上产生的条带确定基因型：TNFB1纯合子可被完全酶切为586bp、196bp 2条带；TNFB1/TNFB2杂合子不完全酶切，出现782bp、586bp、196bp 3条带；TNFB2纯合子不产生酶切，只出现782bp1条带(见图1)。

图1 TNF-β NcoI位点PCR-RFLP电泳图谱

M: DNA分子质量标准；1、2为TNFB1纯合子， 3、5为TNFB2纯合子，4、6、7、8、9为TNFB1/TNFB2杂合子

1.2.3 实验数据监测：为确保实验数据的准确，减少误差，基因型的分型均由两个人判读，并随机抽取15%重复，同时随机抽取10%PCR产物直接测序（上海英骏生物技术有限公司），准确率均为100%。

1.3 统计学处理：数据应用Exce1 2000软件进行统计分析，基因型分布比较采用X2检验。

2结果

2.1健康人群TNFβNcoI位点基因频率分析：广州地区汉族健康儿童人群TNFβNcoI位点有TNFB1*1、TNFB1*2、TNFB2*2 3种基因型,频率分别为24.74%、49.69%和25.57%，TNFB1等位基因频率49.6%, TNFB2等位基因频率50.4%。其分布特征与东亚黄种人相似（P>0.05），与欧美白种人及西亚人群有显著性差异（P

表1不同种族间正常人群肿瘤坏死因子βNcoI位点多态性比较

N(%) 中国 韩国[2] 日本[3] 意大利[4] 土耳其[5] 美国[6] 德国[7]

基因型频率 n=481 n=613 n=211 n=278 n=146 n=101 n=110

TNFB1*1 119(24.3) 115(18.8) 36 (17.1) 6(2.2) 88(60.3） 10(9.9) 8(7.3)

TNFB1*2 239(49.9) 318(51.9) 101 (47.9) 62(22.3) 45(30.8) 34(33.7) 47(42.7)

TNFB2*2 123(25.8) 179(29.3) 74 (35.0) 210(75.5) 13（8.9） 57(56.4) 55(50)

基因频率 n=962 n=1226 n=422 n=556 n=292 n=202 n=220

TNFβ1*1 477(49.6) 548(44.7) 173(41) 74 (13.3) 221 (76) 54(26.7) 63(28.6)

TNFβ2*2 485(50.4) 678(55.3) 249(59) 482 (86.7) 71 (24) 148(73.3) 157(71.4)

X2 0.48 1.49 28.90 14.92 10.58 9.28

P 0.479 0.201 0.00001 0.0001 0.001 0.002

2.2 健康组与疾病组TNFβNcoI位点基因型及基因型频率频率比较

表2 TNFβNcoI位点基因型频率及基因型比较

基因型频率 n(% )TNFB1*1TNFB1*2TNFB2*2X2 P

疾病组 136 25（18.4）67（49.2）44（32.4）3.690.15

健康组 481119（24.3）239（49.9） 123（25.8）

基因频率 n(% ) TNFB1TNFB2 X2P OR

疾病组 272117（43.0）155（57.0）0.98 0.320.75

健康组 962477（49.6）485（50.4） 95% CI= (0.43-1.32

2.3 Hard-Weiberg 平衡吻合度检验:按H-W 定律作吻合度检验, 结果见表3。各组平衡吻合度之间无显著性差异( P>0.95), 表明样本符合Hard-Weiberg平衡, 获得的数据是可靠的。

表3 Hard-Weiberg 平衡吻合度检验

健康组基因型 观察值期望值E X2P

TNFβ1*1 119 118

TNFβ1*2 239 241

TNFβ2*2 123 122

合计481 4810.0170.992

疾病组基因型观察值 期望值EX2P

TNFβ1*1 25 25.1

TNFβ1*2 67 66.7

TNFβ2*2 44 44.2

合计 136 136 0.00011

３讨论

随着人类基因组学研究的深入，已认识到疾病是由环境因素(病原微生物等)和遗传因素共同作用的多基因征侯群，个体遗传学机制的差异性是个体差异的内因物质基础。促炎／抗炎反应失控与炎症性疾病的发生发展密切相关，而TNFβ是主要炎性细胞因子之一，对其进行基因多态性研究，可为炎症性疾病如全身炎症反应综合征易感人群的早期识别、预后分析和免疫治疗提供新的理论依据。

本研究对481名广州地区汉族健康儿童的TNFβNcoI位点多态性进行基因分型。实验结果表明此多态性在广州汉族中的分布是相当广泛的。基因频率分布与白种人及西亚人群有明显的差异，TNFβ*1等位基因频率占24.3%远远高于欧美白种人的2.2-9.9%，低于西亚人群的76 %；而与东亚黄种人的分布特征相似，无显著差异。疾病的发病率在不同种族间存在着明显的差异, 因此, 在对一些致病基因多态性进行研究时, 首先了解其在人群中的分布特点是正确分析和阐述基因多态性研究结果的关键。上述结果为从基因水平上研究TNFβ基因NcoI位点多态性与疾病的关系奠定了基础。

有报道表明TNFβNcoI位点多态性与系统性红斑狼疮、胃癌、胰岛素依赖性肥胖等疾病易感性相关[ 2、3、8]，但尚未有研究表明TNFβNcoI位点多态性与中国汉族儿童SIRS易感性有否关联。本研究通过对136例SIRS患儿及481例健康儿童的TNFβ基因NcoI位点进行基因多态性分析, 发现SIRS患儿TNFβNcoI位点基因型频率及等位基因分布与健康儿童比较, 差异无统计学意义(X2=0.98,P=0.32)；同时对等位基因进行风险评分（OR=0.75, 95% CI= 0.43-1.32），该多态位点的等位基因非SIRS的危险因子。提示TNFβ基因NcoI位点多态性与SIRS易感性无关，该位点多态性不能作为预测SIRS易感性的基因标靶位点。可见虽TNF是体内具有多种生物活性的重要致炎细胞因子, 具有广泛的诱导炎症和免疫调节功能, 机体存在SIRS时，其炎性级联反应错综复杂，纵横交错，致炎因子的基因分子水平多态变异作用在级联网络中的也是复杂多变的，需不断研究探索及查找出有重大作用及意义的基因变异位点。

本研究经过对广州地区健康汉族儿童群体及SIRS患儿的TNFβ基因NcoI位点多态性分析，结果表明： TNFβNcoI位点多态性在汉族中普遍存在，分布特征与白种人存在差异;TNFβ基因NcoI位点多态性与SIRS易感性无关, 其等位基因非SIRS的危险因子。样本为H-W平衡群体。

【参考文献】

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