以氨基酸为手性源的手性固定相研究进展
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【摘 要】氨基酸类手性固定相由于其广泛的来源和较高的拆分能力，在手性拆分中得到广泛应用。本文首先对现有氨基酸类手性固定相进行了归纳和分型，进而简要介绍了各型手性固定相的化学结构、性能及其优缺点。并对其应用和发展前景进行了展望。
【关键词】氨基酸；手性固定相；性能；结构
[Abstract] Chiral stationary phases of Amino acids due to its wide range of sources and high separation ability has been widely used in chiral separation. In this paper， firstly， the chiral stationary phases of the existing amino acids were summarized and typed， and then the chemical structure， performance， advantages and disadvantages of various types of chiral stationary phases of amino acids were described briefly. The trends of the developing and application of chiral stationary phases of Amino acids are also proposed.
[Keyword]Amino acids；Chiral stationary phases；performance；structure
近几年，由于酶催化和不对称合成的发展，出现了许多新型手性药物，由于不同构型的手性药物具有不同的药理活性[1，2]，因而对外消旋体的手性拆分成为必然趋势。目前常用的分离手段是高效液相色谱法、气相色谱法、薄层色谱法、毛细管电泳法和超临界流体色谱法[3-7]。在这几种分析手段中高效液相色谱法由于其良好的在现性和选择性并且易于自动化操作成为最有效的分离手段[8]。并因此合成了一系列的液相手性固定相[9-12]。
本文在现有手性固定相研究成果的基础上，简要概括了有关氨基酸类手性固定相的发展现状。
1.氨基酸类手性固定相―分类
目前国内外氨基酸类手性固定相大致可分为以下几种类型：
1.1 刷型手性固定相
刷型手性固定相因其结构而得名，是发展较早和较为成熟的一种手性固定相。刷型手性固定相具有特定的化学结构，如需含有π-酸或π-碱的芳香性基团、氢键给体-受体基团、极性基团或大体积的非极性基团[13-16]。
对此固定相研究较早的是Pirkle课题组，因其对此突出的贡献，刷型手性固定相也称Pirkle固定相。其代表性的以氨基酸为手性源合成的固定相有：（R）-苯甘氨酸的DNB衍生物CSP（DNB-PG CSP）和（R）-亮氨酸的DNB衍生物CSP（DNB-Leucine CSP）手性固定相，其结构见图1。它们在拆分醚基。烷基或是氨基酸取代的给电子芳香环的对映体有很好的效果[17-21]。经过大量的试验Pirkle还总结出3，5-二硝基苯甲酰氯作为封端基团在其分离的手性药物中效果最好。
（a） DNB-PG CSP 结构图
（b） DNB-Leucine CSP结构图
图1 两种氨基酸固定相结构图
C. Daban Haurou等[22]以L-脯氨酸为手性源，合成了四种手性固定相分别改变了固定相的链长和结构，其结构式见图2。以适宜的流动相，通过核磁共振阐释了手性识别的过程。通过实验分析比较得出：合成的手性固定相良好的空间结构和较长的烷基链有利于提高手性固定相的手性识别能力。
n=3 CBZ L PRO C3 CSP1
n=11 CBZ L PRO C11 CSP2
n=3 CBZ L PRO C3 CSP3
n=11 CBZ L PRO C11 CSP4
图2 四种脯氨酸固定相结构
Zilin Chen等[23]合成的3，5-二甲基苯基甘氨酸手性固定相，如图3。在其合成的7种不同链长和不同链结构的手性固定相中，发现固定相链的长度和含有仲胺的多少对柱子的手性识别能力有很大影响，但是本文作者发现随着链长度的增加仲胺对固定相手性识别能力的影响越来越弱。同时还分析出适宜的流动相对手性分离有很大影响。
图3 7种3，5-二甲基苯基甘氨酸手性固定相
Kenichiro Todoroki等[24]以脯氨酸为手性源合成了Dress-up手性柱，在此手性柱分离了7种外消旋的氨基酸，并且此柱的稳定性、在现性和洗脱性都很好，不仅能用于微量分析，也可用于大量的有机合成。
徐修容等[25]制备了不同取代基团的手性L-缬氨酸-酰胺型化学键合固定相，发现简单的酰胺固定相完全没有拆分作用。
此外还有许多工作者在刷型手性固定相做出了杰出的成果，如唐琴梅[26]、刘晋钫[27-28]和吴邦桂[29]等等。刷型手性固定相发展到今天，不再是合成固定相去拆分已有的外消旋体，而是根据要拆分的某种外消旋体结构和特性以及分离原理而设计一个新的手性固定相，从而实现对这种外消旋体的拆分。
1.2 手性配体交换型手性固定相
1961年，Helfferich创立了配体交换色谱（LEC）技术[30]，此后经过不断发展，手性配体交换色谱成为拆分基酸类对映体最有效的方法之一[31]。配体交换色谱的分离机制是配位交换[32]，用于配位的事先金属离子（如Cu2+，Cu+，Ni2+，Ag+，Co2+等，较常用的是Cu2+）结合在聚合物载体上，待分离物通过与金属离子的配位络合作用或与金属离子络合的配体发生交换以实现分离。
祝馨怡等[33-34] 合成了L-苯丙氨酸键合手性配体交换固定相，见图4。此固定相在反向色谱条件下分离了4种DL-氨基酸，并用元素分析和红外光谱对固定相进行表征，且详细考察了流动相pH、金属离子浓度、流速、进样量和柱温等因素对拆分效果的影响，进一步优化了色谱条件。
图4 L-苯丙氨酸键合手性配体交换固定相
陈磊、万谦宏[35]以涂敷的方法合成3种氨基酸衍生物手性配体交换色谱固定相，并对涂敷量、流动相pH等进行了探讨。祝馨怡等[36]合成两种不同键合量的L-脯氨酸手性配体交换色谱固定相，发现不同种类的氨基酸适合不同键合量的固定相。
马桂娟等[37-38]以PGMA/EDMA为载体，分别以L-脯氨酸和L-异亮氨酸合成两种手性配体交换色谱固定相，拆分了十几种DL-氨基酸，且前者可在较高的pH下对两种氨基醇类药物进行拆分，是硅胶基质配体交换色谱固定相无法满足的。
近年发展起来的点击化学被付春梅等[39]应用于手性配体交换色谱固定相的合成，对其稳定性和分离能力进行研究，表明点击化学具有很大的潜力。此外黄晓佳[40]和JIANBIAO MA等[41]分别以L-异亮氨酸和L-脯氨酸制备了手性配体交换色谱固定相，拆分了十几种DL-氨基酸，并且后者对分离机理进行了探讨。
1.3 多肽手性固定相
对于一些特殊的外消旋体，含有单个手性中心的固定相不足以对其进行拆分。这一问题在含有多个手性中心的多肽手性固定相中得到解决。在多肽合成中由于脯氨酸化学结构的特殊性和刚性使其对外消旋体有较高的选择性[42-44]。因而在多肽手性固定相的合成中手性中心大多是L-脯氨酸。
由三点作用原理[45]可知：在手性分离中氢键起着非常重要的作用。Junmin Huang[46]和Raquel Sancho[47]等以L-脯氨酸为手性源用逐步合成法合成多种肽链型手性固定相，通过流动相的配比和NMR的检测证明氢键在手性分离中的重要性。
Junmin Huang等[48]和Kaname Ohyama等[49]分别以L-脯氨酸和L-苯基丙氨酸合成了多种不同肽链长度的手性固定相，见图5。得出增加肽链的长度和键合壁的长度有力于提高固定相的手性拆分能力。
Junmin Huang固定相
Kaname Ohyama固定相
图5 L-脯氨酸和L-苯基丙氨酸固定相
手性固定相的拆分能力同样受封端基团的影响。Junmin Huang等[50]和Zhi Dai等[51]以L-脯氨酸为手性源合成不同封端基团的手性固定相，对外消旋体进行拆分，发现不同的封端基团有不同的拆分能力，并选出了对所分离的外消旋体的最好封端基团。证明具有空间结构的封端基团拆分能力相对较强。
大多数的手性固定相均以单键合壁的形式合成，而Wenjian Lao等[52]合成一种双键合壁的手性固定相，其拆分能力强于单键合壁。并对离子型键合壁进行了探讨。
二维液相在分离复杂手性样品是非常重要的技术，Meiyun Xue等[53]以苯基甘氨酸为手性中心，通过引入叠氮基合成二肽手性固定相，并与C18柱连用形成二维的反向色谱手性固定相。研究正明这种二维的固定相有很强的拆分能力。
Junmin Huang等[54-55]在以氨基酸为手性源合成十多种手性固定相，对萘酚实现了有效的拆分。此外Raquel Sancho[56]、Ye Bao[57]和Junmin Huang[58]等在多肽手性固定相的合成中取得了不少研究成果。
1.4 其它含氨基酸的手性固定相
其是以氨基酸为手性源的手性固定相，包括聚合物手性固定相和环糊精手性固定相等。
聚合物手性固定相是一种聚合的大分子手性物键合到载体上而制成的手性固定相。M. Mizanur Rahman等[59-60]以L-苯丙氨酸衍生物为手性源合成聚合物手性固定相。此固定相与ODS-p柱相比虽表面覆盖率低且烷基链不规则，但由于π-π键的相互作用对PAHs有较高的拆分能力。同时Atsuomi Shundo等[61]以L-丙氨酸为手性源和合成的聚合物手性固定相对PAHs也有较强的拆分能力。
环糊精手性固定相是研究比较成熟的一种手性固定相。冯钰等[62]以甘氨酸衍生化环糊精键合硅胶制成环糊精手性固定相。考察了丹磺酰化氨基酸异构体、苯丙酸类药物等的分离性能，研究了流动相中甲醇浓度、pH以及柱温对色谱保留行为的影响。杜祖银[63]以（L）-DNP-氨基酸修饰β-环糊精合成环糊精手性固定相，并对其性能进行评价。孙立权[64]合成苄氧羰基苯丙氨酸环糊精衍生物键合硅胶固定相，并对此固定相进行表征，实现了硝基苯酚和氨基苯酚对应异构体的分离。
2.展望
随着生物工程和生物科学的发展，手性药物以单一异构体形式上市已成为必然趋势，与此紧密相关的手性对映体的拆分也越来越重要，这是促进手性固定相发展的源泉。手性固定相发展到今天已有多种类型，如刷型手性固定相、纤维素手性固定相、环糊精手性固定相、大环抗生素手性固定相、蛋白质手性固定相和分子印迹手性固定相等。
氨基酸由于其广泛的来源而作为手性中心广泛的应用到各种手性固定相中，成功的拆分了部分手性化合物。然而由于手性对映体种类繁多和结构复杂等问题，所合成的氨基酸类固定相也面临着选择性低和拆分范围窄等问题。相信随着科技的进步，这些问题都会逐步得到解决。
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作者简介：
黄德友（1988-），男，硕士生；蒋登高（1947-），男，教授，博士生导师，主要从事化工热力学、精细有机合成及新型功能材料的研究。