流式细胞术检测急性冠脉综合征患者血小板表面糖蛋白的变化

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【摘要】 目的 探讨急性冠脉综合征患者及其服用阿司匹林前后血小板表面糖蛋白的变化及其意义。方法 采用流式细胞仪(FCM)测定急性冠脉综合征患者阿司匹林治疗前后的全血中血小板表面糖蛋白(CD62p /PAC1)的表达率，采用自身对照分析阿司匹林对血小板表面糖蛋白的影响。结果 急性冠脉综合征组治疗前的血小板表面糖蛋白PAC1、CD62p的表达率分别为(10.36±6.15)％和(10.72±7.12)％，较健康对照组明显升高(P

【关键词】

急性冠脉综合征；血小板表面糖蛋白；流式细胞术

作者单位：100083北京市第六医院心内科

随着人群的老龄化，动脉粥样硬化所带来的血栓栓塞性疾病越来越受到重视，特别心脑血管疾病，其致残率和致死率高，近年来阿司匹林的使用可以使心脑血管疾病高危患者降低25%的心脑血管病事件如死亡，心肌梗死，卒中；降低48%的血管搭桥及动脉栓塞事件；减少肺栓塞事件67%［1］。但是有大规模的临床观察及实验研究［24］均发现有阿司匹林抵抗现象。临床长期随访时上发现应用在使用抗血小板药物后，仍然有一部分心脑血管疾病患者血栓栓塞事件，加大治疗剂量，不仅未能达到治疗及预防目的，而且不良反应增加，这种现象称为“阿司匹林抵抗”(Aspirin resistance AR)。所以对于危险程度高的冠心病患者需要强化抗血小板治疗，即联合多种抗血小板药物治疗，这种强化治疗很需要一种非常敏感而且可靠的血小板功能的检测方法作为参考。但是目前尚没有一个公认的血小板功能检测方法，大多都是反映血小板聚集的实验，而流式细胞术是通过检测血小板活化时血小板表面的糖蛋白的表达，从免疫、受体水平评估血小板功能。本研究就是利用流式细胞仪(FCM)测定不同危险程度的急性冠脉综合征(ACS)患者的血小板表面糖蛋白的表达水平对其进行分析及意义及FCM的可行性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本院自2010年4月至2010年9月连续入院的38例符合WHO诊断标准的初治的ACS患者(非ST抬高25例，不稳定性心绞痛13例)，男21例，女17例，平均年龄为71.6岁。所有患者均经心肌酶、心肌损伤标志物，心电图，急诊或择期冠脉造影证实。入院后每天于晨起餐后服用阿斯匹林100 mg，连续服用7~10 d，其他抗心肌缺血药物均按指南使用，治疗期间禁止使用其他明确的抗血小板药物，如：波立维，抵克利得，GPⅡb/Ⅲa受体拮抗剂。排除标准：明确ST段抬高型心肌梗死，合并有各种血液系统疾病，具体如下：血友病、白血病、再障、ITP等特别是有血小板功能异常者；近期有外伤、手术及出血史；合并有肝肾疾病、肿瘤、脾亢、脑出血者；血小板计数在100~450万之外者。健康对照组(Control)22 例为同期我院无明显心脑血管疾病的门诊体检者,男12例,女10 例,平均年龄68.5岁。

1.2 方法

1.2.1 主要仪器

FACSCalibar流式细胞仪为美国BD公司产品,Falcon 上样管。

1.2.2 主要试剂

①单克隆抗体: PAC1 FITC 为异硫氰酸荧光素标记的抗GP Ⅱb/Ⅲa (即纤维蛋白原受体, FibR) McAb,CD62P PE 为藻红蛋白标记的抗P2选择素的McAb ; CD61 PerCP 为Peridininchlorophyll protein 标记的血小板糖蛋白Ⅲa 的McAb(均购自美国BD 公司)。② 同型对照:异硫氰酸荧光素标记Mouse IgM、MousePE 为藻红蛋白标记的鼠IgG(均购自美国BD 公司)。

1.2.3 样本采集 病例组入院后服用阿司匹林前以及经治疗7~10 d病情稳定后分两次于晨起7时抽取肘前静脉血,不扎止血带,弃去前2 ml可能混有组织液的血液,将样本加入CTAD管中,轻轻混匀，避免剧烈的摇动而影响对血小板的检测。20 min内对血小板进行荧光标记、固定、检测。

1.2.4 标本制备 将试管标号区分对照管和实验管。对照管内加入RGDS、MouseγPE、CD61 PerCP 各10 μl;试验管加入PAC1 FITC、CD62P PE、CD61 PerCP 各10 μl,轻轻混匀,避光室温孵育20 min,立刻加入预冷2～8℃的1 %多聚甲醛0.5 ml并混匀,放置于2～8 ℃冰箱中30 min。以上步骤均在2 h内完成,以减少血小板体外活化。标本制备后进行上机检测。

1.2.5 上机检测 用CellQuest软件获取并分析样本，具体如下：a、FSC和SSC设对数放大阈值设在CD61PerCP上，b、在SSC和CD61PerCP点图上圈定所有的血小板群，包括与白细胞粘附的血小板。c、用同型对照抗体染色的标本调整FL1和FL2电压如：CD61PerCP/同型对照FITC/同型对照PE，d、活化血小板染色的标本调节补偿,CD61PerCP/PAC1 FITC/同型对照PE 调节FITC对PE的干扰。e、CD61PerCP/同型对照FITC/CD62PPE调节PE对FITC的干扰。

1.2.6 统计学方法 应用SPSS 11.5 统计软件进行统计分析,计量资料用均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用t检验，治疗前后血小板糖蛋白之间的比较采用自身配对t检验。

2 结果

38位入选的病例均圆满完成实验，住院期间无心源性死亡及其他心源性事件发生、无严重的出血事件。ACS组的PAC1及CD62P表达均高于Control组(P

表1

各组治疗前后血小板表面CD62P、Pac1 的表达率(%)

例

治疗前治疗后

PAC1(%)CD62P(%)PAC1(%)CD62P(%)

ACS3810.36±6.15＊10.72±7.12＊4.90±2.37＃＊4.32±2.08＃＊

Control221.82±0.922.02±1.7

注：＊P

3 讨论

近年来，随着我国人口老龄化程度日益加剧及人民生活水平的提高，血栓性疾病的发生率不断上升，血栓栓塞性疾病达到前所未有的重视，常表现为心肌梗死、缺血性脑卒中、外周血管栓塞性疾病。其中心血管疾病已成为当今世界上威胁人类最严重的疾病之一，其发病率和死亡率已超过肿瘤性疾病而跃居世界第一［5］。

在血小板活化早期,血小板空间构型发生改变,血小板膜糖蛋白GPⅡb/Ⅲa 复合物构型改变,其纤维蛋白原受体暴露,促进纤维蛋白原与GPⅡb/Ⅲa 的相互识别和结合［6］。Pac1 为GPⅡb/Ⅲa 复合物纤维蛋白原受体,在血小板活化后,GPⅡb/Ⅲa 受体的活性表达是引起血小板聚集的最后通路,检测血小板表面Pac1 的表达量可以更精确地在更早阶段检测到血小板的活化。

P选择素(Pselection，gmp140)又名血小板活化依赖性颗粒表面膜蛋白或CD62P，位于血小板内的α颗粒和内皮细胞棒管状小体内。血小板活化时, 血小板α颗粒膜与质膜融合,CD62P暴露于血小板质膜表面,成为血小板活化的一个特征性指标［7］。CD62P 通过血小板P2选择素介导血小板黏附于内皮细胞及血小板与中性粒细胞、血小板与单核细胞连接,从而产生中性粒细胞激活,血管活性物质、氧代谢产物释放,纤维蛋白原沉积等多种生物学效应,启动血栓形成过程。CD62P 与血浆黏度、纤维蛋白原浓度呈正相关［8］,因此,CD62P的升高可作为血栓疾病的病情监测和评价血栓前状态的有效指标。

本研究ACS组治疗前CD62P/PAC1两者都明显高于对照组(P

参 考 文 献

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