姜黄素与紫杉醇联用对人子宫内膜癌细胞增殖的影响及其机制研究

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[摘要] 目的 探讨姜黄素（CCM）与紫杉醇（PIX）联用对人子宫内膜癌细胞（Ishikawa）增殖的影响及其机制。 方法 （1）设置对照组（不加药物）、CCM组（不同浓度的CCM）、PIX组、联合组（PIX联合不同浓度的CCM）；（2）采用MTT法检测不同浓度的CCM联合PIX对细胞活力的影响；（3）流式细胞术检测细胞凋亡率；（4）免疫组化法检测Caspase-3蛋白表达情况。 结果 CCM联用PIX能抑制人子宫内膜癌细胞的增殖（P < 0.05），且随CCM浓度的增加，抑瘤作用增加；两种药物均可诱导细胞凋亡，且各组凋亡率与药物浓度呈正相关（P < 0.05）；免疫组化结果显示随着染毒浓度的增加和联合作用，Caspase-3蛋白的表达升高（P < 0.05）。两药联用抗瘤作用增强。 结论 CCM、PIX均可抑制人子宫内膜癌细胞的增殖、诱导细胞凋亡、上调细胞Caspase-3表达，呈剂量依赖性，且两者联用具有协同作用。

[关键词] 姜黄素；紫杉醇；Caspase-3；子宫内膜癌；增殖；凋亡

[中图分类号] R737.33 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2013）06（b）-0021-03

姜黄素（curcumin，CCM）是从姜科植物姜黄中提取的一种酚性化合物，毒性低，耐受性好，具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎[1-2]、抑制血管增生、降血脂[3-5]等多种药理作用。近几年的研究表明，姜黄素具有抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡的作用。紫杉醇（paclitaxel，PIX）是子宫内膜癌的常规化疗用药，但由于药物毒性及耐药性使其实际疗效与人们期望的相差很大。本实验主要研究CCM与PIX联用对人子宫内膜癌细胞株增殖的影响及其机制，探讨其是否有协同作用，为CCM应用于临床提供基础理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人子宫内膜癌细胞株（Ishikawa）（上海复祥生物科技公司）；姜黄素（Sigma公司）；紫杉醇（哈药集团）；兔抗人Caspase-3多克隆抗体、Sp Rabbit HRP Kit（羊抗兔）（北京康为世纪公司）；AnnexinV-FITC试剂盒（凯基公司）；胎牛血清（四季青）；RPMI-1640培养液、0.05%胰蛋白酶、MTT细胞增殖试剂盒、二甲基亚砜（DMSO）等试剂。姜黄素用DMSO溶解为25 mmol/L，4℃冰箱保存，用时稀释到工作浓度。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

将人子宫内膜癌细胞接种于培养瓶中，培养基为含10%新生小牛血清的RPMI-1640，置37℃，5%CO2培养箱培养，待细胞长满培养瓶80%～90%时，0.05%胰蛋白酶消化。

1.2.2 MTT法检测细胞增殖抑制率

1.2.2.1 CCM对Ishikawa细胞增殖的影响 用0.05%胰蛋白酶消化对数生长期的Ishikawa细胞后，加入培养基终止消化，调整细胞数为3×104个/mL，各取100 μL细胞悬液接种于96孔培养板，放入培养箱中培养24 h，弃上清，加入含不同浓度CCM的培养基，使其终浓度为3.33、6.67、16.67、33.33、66.67 μmol/L，每个浓度设5个复孔。同时设空白对照孔（仅含培养基）、对照孔（细胞、培养基）。继续培养48 h后，每孔加入5 g/L的 MTT溶液10 μL，继续培养4 h后，每孔加入100 μL的Formanzan溶解液，置摇床上低速振荡30 min。在490 nm的波长下测定各孔吸光度值（OD值）。细胞生长抑制率（%）=（1-实验组OD值/对照组OD值）×100%。

1.2.2.2 PIX联用不同浓度CCM对Ishikawa细胞增殖的影响 处理同上，设对照组、CCM组（不同浓度CCM）、PIX组（50 μg/mL）、联合组（PIX 50 μg/mL联合不同浓度的CCM）。在490 nm的波长下测定各孔吸光值。联合用药对细胞增殖抑制率按下式推测[6]：q=E（AB）/[EA+（1-EA）×EB]。其中E（AB）为两药合用的抑制率，EA和EB为两药单用的抑制率，q=0.85～1.15表明两药作用相加；q>1.15表明两药作用协同；q

1.2.3 流式细胞术检测细胞凋亡率

取单细胞悬液接种于6孔板中培养后，加药物。设对照组、CCM组（3.33、6.67、16.67 μmol/L）、PIX组（6 μg/mL）、联合组（PIX 6 μg/mL联合CCM 3.33 μmol/L），继续培养24 h后去废液，PBS洗涤，离心收集细胞，PBS洗涤，调整细胞浓度5×105个/mL，加入200 μL Binding Buffer液悬浮细胞，再加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI混匀，室温避光反应20 min，用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.4 免疫组化法检测Caspase-3的表达

将无菌盖玻片置于6孔板中，每孔加入单细胞悬液于盖玻片上，待细胞贴壁后加入培养液培养24 h后，去上清，加药物，设对照组、CCM组（6.67、16.67、33.33 μmol/L）、PIX组（50 μg/mL）、联合组（PIX 50 μg/mL联合CCM 16.67 μmol/L），继续培养48 h，去废液，PBS洗涤，4%多聚甲醛固定30 min后，PBS洗涤，采用SP法，以细胞核或细胞质内出现棕黄色颗粒为阳性作为结果判定。

1.2.5 统计学分析

采用SPSS 19.0软件对所得数据进行统计学分析，所有数据采用均数±标准差（x±s）表示，采用单因素方差分析。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 CCM单独及联合PIX对人子宫内膜癌细胞Ishikawa的增殖抑制效应

MTT法表明，不同浓度的CCM作用于人子宫内膜癌细胞的吸光度值均较对照组低（P < 0.01），表明CCM对人子宫内膜癌细胞的增殖有显著抑制作用，且随着染毒剂量的增加，抑制率升高。CCM与PIX联用抑瘤作用明显强于单独应用CCM、PIX组。CCM与PIX联合q>1.15，表明两药作用协同（表1）。

2.2 不同浓度的CCM联用PIX对人子宫内膜癌细胞Ishikawa凋亡的影响

流式细胞术结果显示，CCM组、PIX组及联合组人子宫内膜癌细胞Ishikawa的凋亡率均显著高于对照组（P < 0.01），随着CCM剂量的增加，凋亡率呈升高趋势（P < 0.05），且联合组凋亡率又分别高于单用CCM、PIX组（P < 0.01）（表2）。

2.3 Caspase蛋白表达的结果

与对照组比较，各实验组中Caspase-3蛋白的表达均升高，且随CCM浓度的升高，Caspase-3的表达升高，联合组Caspase-3蛋白的表达分别高于单独应用CCM、PIX组，差异有统计学意义（P < 0.05）（表3）。

3 讨论

子宫内膜癌为女性生殖道三大恶性肿瘤之一，也是常见的妇科恶性肿瘤，占女性全身恶性肿瘤的7%，占女性生殖道恶性肿瘤的20%～30%[7]。近年来此病发病率呈上升趋势，在部分国家发生率已高于宫颈癌，成为最常见的女性生殖道恶性肿瘤[8]。细胞凋亡对子宫内膜癌的发生起负性调节作用。细胞凋亡与Caspase的激活有关，半胱氨酸蛋白酶Caspase-3是Caspase家族成员中执行细胞凋亡的关键蛋白酶，激活后产生诱导细胞凋亡的作用。在子宫内膜癌组织中，Caspase-3处于低表达水平，可以抑制肿瘤细胞的凋亡，可能是子宫内膜癌发病机制之一。

姜黄素具有抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡的作用[9]，可以通过多种途径产生抗肿瘤作用。目前普遍认为可能主要与诱导肿瘤细胞凋亡有关。近年来已有姜黄素对卵巢癌细胞、宫颈癌细胞、子宫内膜癌细胞等妇科肿瘤细胞增殖和凋亡的影响的研究报道[10-11]。李伟宏等[12]研究表明，姜黄素可明显抑制子宫内膜癌细胞增殖，诱导细胞凋亡。化疗是治疗子宫内膜癌的有效措施，但由于药物毒性及耐药性使其实际疗效与人们期望的相差很大。紫杉醇是一种新的抗微管药物[13-14]，是治疗子宫内膜癌有效的化疗药物，是通过诱导细胞凋亡途径实现对子宫内膜癌细胞的杀伤作用的。姜黄素与传统化疗药物的联合使用，不仅可以增强传统化疗药物的抗癌效应，而且可以降低不良反应和耐药的发生率。

本实验表明，姜黄素、紫杉醇均可抑制人子宫内膜癌细胞的增殖、诱导细胞凋亡、上调细胞Caspase-3表达，随着姜黄素剂量的增加，其抗瘤效应也随之增加，且两者联用具有协同作用。本实验通过对联合用药作用的研究为临床治疗子宫内膜癌提供新途径、新思路及基础理论支持。姜黄素来源广泛、价格低廉、毒性小[15]，不仅具有抗肿瘤作用，而且还可以增强化疗药对肿瘤细胞的杀伤作用，减少化疗药的用药剂量及毒副作用[16]和耐药的发生率，它是一种较理想的化疗增效剂和保护剂。姜黄素和紫杉醇联合应用治疗子宫内膜癌，通过体外实验研究为临床应用提供了理论依据。

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（收稿日期：2013-03-19 本文编辑：林利利）