两种叶绿素提取方法的比较

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摘要：以5种植物叶片为试验材料，采用分光光度法研究了4种提取溶剂及两种提取方法对植物叶片叶绿素提取量的影响。结果表明，两种提取方法中，丙酮与乙醇的混合溶剂提取整体上好于丙酮、乙醇单独提取的效果；浸提法中，浸提时间为18 h和24 h效果较好，且浸提时间的增加降低了提取溶剂的影响。生产上采用混合溶剂提取时，浸提18 h是较为理想的选择。

关键词：叶绿素；提取方法；比较分析

中图分类号：Q244；TS202.3 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）21-5303-02

Comparative Analysis of Two Extraction Methods of Chlorophyll

XU Xin-juan，LI Yong-chao，ZHANG Shang-pan，SHEN Qi，ZHANG Zhen-guo

（Henan Institute of Science and Technology， Xinxiang 453003，Henan，China）

Abstract： With five plant leaves as the experimental material， the effects of four extraction solvents and two extraction methods on chlorophyll content were studied by spectrophotometry. The results showed that the extraction efficiencies of chlorophyll using mixed solvent were better than using acetone or ethanol alone. The results were better with the extraction time 18 h and 24 h， respectively， and the effect of extraction solvent was reduced with increasing extraction time. In production， extraction time of 18 h is an ideal choice with mixed solvent as extraction solvent.

Key words： chlorophyll； extraction methods； comparative analysis

植物叶片叶绿素含量与光合作用关系密切，叶绿素含量的测定无论是在生理上还是在选育品种以及抗性研究等方面都很有必要性。分光光度法是测定叶绿素含量的经典方法，传统的叶绿素提取方法为研磨法，即植物材料经过研磨、过滤或离心、定容后再进行比色测定，整个过程繁琐且误差较大，操作中还易受光氧化的破坏，不适于对田间大量样品的测定和大量叶绿素的提取，也不适合大批量样本的应急检测。随后提出的浸提法采用溶剂浸泡叶片的方法将叶绿素萃取出来，然后进行比色测定。直接浸提植物叶样并测定叶绿素提取量，免除了传统提取中研磨、离心过滤等繁琐手续，方法简单易行、效率高，且减少了误差来源，稳定性好。王元军[1]研究指出，研磨法提取黑豆芽菜叶绿素的效果好于浸提法，但很多植物上的应用结果显示浸提法比研磨法提取叶绿素效率更高且稳定性好[2-4]。但浸提法受多种提取试剂的影响，并且浸提时间的长短也影响最终的测定结果。因此，本研究以5种植物叶片为试验材料，采用4种不同的溶剂分别用研磨法和浸提法提取叶绿素，测定叶绿素提取量，研究浸提溶剂及浸提时间对叶绿素提取量的影响，并对浸提法和研磨法两种提取叶绿素的方法进行比较，以期为植物叶绿素的提取和测定提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为玉米、大豆、棉花、三叶草、爬山虎的叶片，均取自河南科技学院试验田。丙酮、95%乙醇及无水乙醇均为分析纯试剂。

1.2 方法

提取溶剂设80%丙酮、95%乙醇、混合溶剂Ⅰ（V丙酮∶V无水乙醇=1∶1）、混合溶剂Ⅱ（V丙酮∶V无水乙醇=2∶1）。选择正常生长的新鲜健全植物叶片，用纱布擦净表明污物，避开主脉进行取样。剪碎后称取约0.20 g，一组用不同溶剂研磨并定容至25 mL，过滤后分别测定提取液在663 nm和645 nm处的吸光度；另一组用不同溶剂直接浸提，浸提时间为6、12、18和24 h，然后测定浸提液在663 nm和645 nm处的吸光度。每次测定3次重复。采用Arnon公式计算叶绿素含量：

叶绿素a含量（Chla，mg/g）=

（12.7×A663 nm-2.69×A645 nm）×V/1 000×W

叶绿素b含量（Chlb，mg/g）=

（22.9×A645 nm-4.68×A663 nm）×V/1 000×W

叶绿素总含量（Chla+Chlb，mg/g）=

（8.02×A663 nm+20.21×A645 nm）×V/1 000×W

式中，A663 nm、A645 nm分别为相应波长下叶绿素提取液的吸光度，V为提取液体积，W为叶片鲜重。叶绿素含量单位为mg/g。

1.3 数据分析

所有数据取平均值，采用SAS 9.0进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 研磨法中提取溶剂对叶绿素提取量的影响

从表1可以看出，研磨法中不同溶剂对植物叶绿素提取量的影响也不同，整体上混合溶剂的提取效果好于单一溶剂。除大豆、三叶草外，其余3种植物用混合溶剂Ⅱ提取的叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素的提取量最大，且显著高于80%丙酮和95%乙醇的提取结果（P

2.2 浸提法中提取溶剂及浸提时间对总叶绿素提取量的影响

从浸提溶剂来看，混合溶剂的提取效果仍显著高于单一溶剂（表2）。从浸提时间上，浸提6 h时，用混合溶剂提取的总叶绿素提取量均高于单一溶剂的提取结果，其中混合溶剂Ⅱ的提取效果整体最好，80%丙酮的提取效率最低。浸提12 h的结果与6 h基本一致。随着浸提时间的增加，混合溶剂的提取效率也逐渐提高。浸提18 h时两种混合溶剂的提取结果没有显著差异，24 h后95%乙醇的提取效果与混合溶剂相当，其中三叶草4种溶剂的提取效果没有显著差异。这表明在浸提时间短的情况下，浸提溶剂的不同是决定提取效果的关键因素，当浸提时间达到一定程度后，溶剂的影响减小，但整体上乙醇的加入改善了提取效果。生产上宜选择18 h或24 h进行浸提，以获得最佳的提取效果。

2.3 两种提取方法提取总叶绿素含量的比较

由表3可知，浸提法4个提取时间的结果与研磨法均无显著差异，表明浸提法提取叶绿素可以达到传统研磨法的效果。

3 小结

叶绿素的两种提取方法中，浸提法虽然在提取结果上与研磨法相当，但提取过程优于传统的研磨法。丙酮与乙醇混合溶剂的提取效果显著高于单一溶剂，不同的浸提时间也影响叶绿素的最终提取量。生产上采用浸提法提取植物叶绿素时，混合溶剂的效果较好，提取时间以18 h为佳。在浸提法中除了注意混合溶剂的各成分的比例外，还要考虑提取程度、提取效率以及提取液的稳定性。

参考文献：

[1] 王元军.黑豆芽菜叶绿素的提取方法[J].食品研究与开发.2010，31（2）：27-29.

[2] 刘绚霞，董振生，刘创社，等.油菜叶绿素提取方法研究[J].中国农学通报，2004，20（4）：62-63.

[3] 李得孝，郭月霞，员海燕，等.玉米叶绿素含量测定方法研究[J].中国农学通报，2005，21（6）：153-155.

[4] 孙俊宝，王建新.樱桃叶绿素含量测定方法研究[J].山西农业科学，2010，38（3）：18-19，33.

[5] 洪法水，魏正贵，赵贵文.菠菜叶绿素的浸提和协同萃取反应[J].应用化学，2001，18（7）：532-535.