RNA干扰与肿瘤基因治疗
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摘要：rna干扰（RNAi）是控制正常基因表达的一种机制，近来作为一种潜在的技术用于肿瘤、传染病和代谢性疾病的治疗。本文仅就RNA干扰的发现、作用机制以及在肿瘤治疗中的应用和所面临的问题做一简要介绍。
关键词：RNA干扰；小干扰RNA；基因沉默；肿瘤
中图分类号：Q522文献标识码：A文章编号：1672-979X(2009)01-0054-04
RNA Interference and Tumor Gene Therapy
JU Ji-yu, LI Zai-lian
(Department of Immunology, Weifang Medical University; Key Laboratory of Immunology in Universities of Shandong, Weifang 261042, China)
Abstract：RNA interference is a mechanism for controlling normal gene expression, which has been employed as a potential technology for a wide range of disorders such as tumors, infectious diseases and metabolic disorders. This paper reviews the discovery, mechanism of RNA interference and its application in tumor diagnosis and prevention, as well as some challenges.
Key words：RNA interference; small interfering RNA; gene silencing; tumor
基因治疗是一种特异性的治疗方法，可用在疾病早期。基因治疗一般是通过一定的技术把遗传物质转入细胞并永久改变细胞表型，例如通过替换变异的肿瘤抑制基因（如p53）、抑制基因转录、引入能编码治疗物质（如scFv）的新基因或者使特定的靶基因沉默（如反义技术）等。RNA干扰（RNA interference，RNAi）是控制基因表达的特异有效方法。近年RNAi已成为研究根据基因功能合理设计药物的重要工具。本文现简要介绍RNAi的发展史和近来在肿瘤基因治疗中的应用。
1RNAi的发现及作用特点
1.1概述
RNAi是指小分子双链RNA抑制同源序列基因的表达，是生物进化过程中保留下来的机制。像反义技术一样，RNAi可以特异的抑制基因的表达。RNAi最早在秀丽新小杆线虫（C. elegans）中发现可以抵御外来基因的入侵。此后陆续在昆虫、植物、真菌和脊椎动物中也发现了该机制。
1.2干扰RNA的分类及作用特点
目前，已知具有功能作用的小分子干扰RNA主要包括小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）、微小RNA（microRNA，miRNA）和Piwi-interacting RNA（piRNA）3类。
1.2.1siRNA的发现及作用机制1993年学者们发现秀丽新小杆线虫中微小RNA和反义互补RNA抑制基因的表达。1995年Guo等[1]用反义RNA技术阻断秀丽新小杆线虫中par-1基因表达时发现，正义RNA和反义RNA均能阻抑基因功能表达，且两者的作用是相互独立的，机制也各不相同。1998年Fire等[2]首次发现双链RNA（dsRNA）能够特异性地抑制秀丽新小杆线虫的纹状肌细胞unc-22基因表达，dsRNA引起的基因沉默效应要比单用反义RNA或正义RNA强十几倍。注入秀丽新小杆线虫的性腺后，在其第一子代中也诱导出了同样基因的抑制现象，表明RNAi有可遗传性。此现象称为RNAi。因为RNAi作用发生在转录后水平，又称为转录后基因沉默（PTGS）。1999年Hamilton等[3]在植物基因沉默研究中首次发现，21~25 核苷酸（nt）的dsRNA出现对转基因导致基因沉默十分重要，同时指出RNAi作用是由部分纯化的核酸酶中所含siRNA介导的。2000年首次在果蝇中发现，通过核糖核酸酶可将长的dsRNA处理为21～23 nt的短片段[4]。2001年，首次报道了哺乳动物细胞中也有RNAi。2002年证明了用短的发夹结构RNA（shRNA）在哺乳动物细胞中可以诱导特异性的基因沉默[5]。2003年首次用RNAi技术对模型动物进行了治疗研究[6]。
哺乳动物体内RNAi的作用机制与植物及果蝇等RNAi的机制相似，体外研究证实，RNAi是一个ATP依赖性的过程。首先，dsRNA通过细胞膜进入细胞，在胞质内的Dicer（一种序列特异性的核酸内切酶，属RNA酶家族III成员）的作用下，分解成21～22 nt；3’端带有2～3个末端突出碱基的dsRNA分子，这种小的dsRNA分子称为siRNA[7]。siRNA与Agonaute2等蛋白酶结合，形成由RNA介导的沉默复合物（RNA-induced silenceing complex，RISC）。RISC大约500 kb，在ATP供能的条件下，RISC可以把其携带的双链siRNA分子变成单链siRNA。含单链siRNA的RISC有活性，可与目的mRNA结合，导致其断裂、降解，从而导致目的基因沉默[8]。
1.2.2miRNA的发现和作用特点miRNA是一种内源性的非编码RNA（noncoding RNA，ncRNA），由大约2l～23 nt组成单链RNA分子。miRNAs广泛存在于植物、线虫和人类细胞中，可能是一类进化上保守的、在生命中起重要调控作用的分子[9]。它们能有效地抑制相关蛋白质的合成，导致靶mRNA降解，或者以其他形式的调节机制抑制靶基因表达，产生基因沉默。Lin-4和Let-7是最早在秀丽新小杆线虫中发现的能时序性地调控胚胎后期发育的基因，这些基因编码一类长度约21 nt的小分子短暂RNA（small temporal RNA，stRNA）[10] 。后来，又相继在线虫、果蝇、HeLa细胞、拟南芥和水稻等许多真核模式生物和细胞中找到了几百个相似的小分子RNA，将其统称为miRNA，Lin-4和Let-7基因编码的stRNA则认为是miRNA的代表[11]。
与siRNA一样，miRNA也可以引发RNAi现象。在miRNA生成过程中，编码miRNA的基因首先转录产生几百至几千核苷酸的初级产物（pri-miRNA），在核内被核酸内切酶Drosha酶切割成约70 nt的发夹状前体（pre-miRNA）。pre-miRNA在Ran-GTP和转运蛋白Exportin-5的协同作用下转运出细胞核，经Dicer酶切割成约22 nt的成熟miRNA。成熟miRNA可通过两种机制调控靶基因表达：一种是和siRNA一样，与靶mRNA结合，促进其降解；另一种是结合到靶mRNA的3＇UTR部位抑制其翻译。如果miRNA与靶序列互补配对高则可能切割mRNA，配对低的可能只是抑制[12]。
1.2.3piRNA的发现2006年由4个独立的研究小组[13，14]在小鼠实验中分离得到一种能与piwi蛋白相互作用的小分子RNA，称为piRNA，由30 nt组成。piwi基因为Argonaute基因家族成员之一，科学家们推测，这类小分子RNA可能与动物体的发育和维持功能相关。实验结果表明，每个精母细胞或完整的细胞中大约含有100万个piRNA[13]。同时，经过克隆也观察到大量26～31 nt的小分子RNA。根据RNA的长度大小，piRNA可分为2种：第1种长29～31 nt，可以和MIWI蛋白连接；第2种长26～28 nt，可以率先与MILI蛋白结合。在成年小鼠体内，第1种比第2种含量高。但由于某些piRNA探针可以检测出30 nt和26 nt区带，所以2种piRNA均可形成相同的分化过程。利用cDNA末端快速扩增技术确定它们的5’端相同，而3’端相差2 nt。这2种piRNA是否发挥不同的作用有待进一步研究。
2在肿瘤学中的应用
最初RNAi在肿瘤学的应用主要是针对突变的肿瘤基因、增生、转位和病毒基因，阐明其功能以及和其它基因之间的相互联系。应用RNAi技术探索各种基因的功能及相互作用为筛选新的药物靶基因提供了便利。RNAi已用来加强现存药物如伊马替尼（imatinib）和雷帕霉素的作用，这是通过沉默抗性相关基因实现的[15]。当用siRNA抑制Prkdc基因（与DNA修复有关的基因）后，人成纤维细胞对射线的敏感性明显增强[16]。抗凋亡基因survivin被认为是诊断和治疗肿瘤的一个很有价值的基因，是RNAi治疗的候选基因[17]。融合癌基因BCR/ABL在人白血病细胞系中成功地被人工合成的siRNA抑制，不但减少了相应基因蛋白的表达，而且诱导靶细胞发生凋亡[18]。用RNAi方法抑制融合基因ALM1/MTG8可增强细胞因子驱动的淋巴母细胞在骨髓中分化。有趣的是，癌基因转录被抑制可以长达5 d。相似的情况是，用RNAi方法抑制培养的EWS/Fil肉瘤细胞癌基因表达可以使细胞生长减慢长达3周[19]。现在已有多种基因用于RNAi治疗肿瘤的研究，如bcl-2、fas、k-ras、myc、p53等。这一方法的前景依赖于siRNA或shRNA能否使癌基因转录沉默并带来相应的生物学效应[20]。
3RNAi所面临的问题
RNAi用于临床肿瘤治疗要解决两个问题，首先如何把有效的干扰RNA带到肿瘤细胞内，对特异性靶基因产生特异性的抑制作用；其次，如何避免RNAi带来的副作用。
3.1载体问题
以前的研究表明，血流中的siRNA或DNA很难通过细胞膜屏障和逃避内体溶酶体的降解作用[21]。为了提高siRNA的运载效率，学者们发展了很多病毒和非病毒运载体系，大大提高了运载siRNA的效率。如基于逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒的运载系统在体内外均实现了RNAi介导的基因沉默[22]。腺病毒由于基因在细胞内表达短暂，应用受到很大限制。逆转录病毒由于其复制过程中要经过DNA中间体过程，能把前病毒整合到宿主细胞基因组上，从而实现稳定表达。用表达siRNA的逆转录病毒加上一些调控元件可实现组织特异性基因沉默[23]。然而，逆转录病毒基因治疗的主要问题是插入变异的问题。腺相关病毒载体可以实现外源基因宿主基因组的定点整合，也可以实现外源基因的稳定表达，但纯化仍然是需要突破的一道障碍[24]。除了病毒载体以外，非病毒载体也用于肿瘤的基因治疗。如阳离子脂质体或聚乙醇胺均用作siRNA运载体。这些载体均已用作体内siRNA实验并在静脉给药或鼻内给药后实现了目的基因沉默。但是，这些载体在体内均表现出毒性和激发机体免疫应答的能力[25]。因此，需要改进这些载体和进一步寻找更加安全的载体。另外一种值得注意的载体是壳聚糖。壳聚糖是一种阳离子多糖，已广泛用于药物的运载，特别是DNA介导的基因治疗药物的运载。壳聚糖的胺带有正电荷，可与核酸上的磷酸形成聚合电解质络合物。而且，这种质子化的胺还有利于复合物与细胞膜结合并被内吞入细胞。现已证明，壳聚糖/siRNA微粒可在体内外介导基因沉默。而且，已证明壳聚糖是生物相容的、非致炎、非毒、可降解的材料。因此，壳聚糖/siRNA运载系统可能具有良好的发展前景[22]。
3.2脱靶效应
如果考虑将siRNA作为治疗药物，须考虑它的序列特异性和评估它的脱靶效应的危险性。例如，必需保证只有目的基因mRNA被降解而其它必需基因不受影响。siRNA产生脱靶效应主要基于以下3个方面：（1）由于shRNA和siRNA均含有dsRNA序列，因此它们可能会诱发机体的天然免疫应答，如干扰素应答。（2）转染或表达的siRNA可能会产生一些非特异性效应。（3）尽管设计的siRNA与目的基因互补，但也可能和非靶基因mRNA互补[26]。
研究表明，dsRNA的长度大于30 bp可以导致非特异性抑制基因表达，大部分是由于激活了dsRNA依赖性的蛋白激酶PRK和随后的磷酸化以及灭活eIF2a 所引起。RNA的长度（siRNA或shRNA）与此有关，即使11 bp的siRN段也可诱导微弱的干扰素应答。有些措施可以减轻干扰素应答，如减少转染siRNA的量，也可通过检测干扰素应答基因如寡腺苷合酶-1的方式预防干扰素应答发生[27]。除了干扰素应答外，另一个脱靶效应就是由于外源siRNA的导入使细胞内RNAi机制饱和，从而抑制内源性RNAi（miRNA）发挥作用，产生非特异性的毒性反应。这就要求在进行外源siRNA转染时尽可能减少外源siRNA的用量[27]。最近用基因芯片进行的研究表明，用RNAi方法抑制慢性髓性白血病细胞中BCR-ABL融合蛋白表达可启动细胞内其它沉默的癌基因、抗凋亡基因和细胞因子的表达[28]。因此，RNAi技术在真正应用到临床之前，需要更加严格的评估。
4展望
把RNAi技术从研究工具转变为治疗手段所遇到的主要问题是载体系统。我们需要更加特异、有效的运载系统，如可以特异性肿瘤靶向的载体或者带有肿瘤细胞特异性启动子的载体系统。由于RNAi主要与细胞胞浆成分作用，这是优于其它基因治疗方法之处。尽管摄取效率和稳定性是建立RNAi治疗方法所遇到的主要问题，但这一领域的飞速发展表明，也许在几年之后，我们就能找到较好的解决办法。
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