小果蔷薇三萜酸类化学成分的研究

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[摘要] 采用柱色谱技术对小果蔷薇Rosa cymosa Tratt.根的95%乙醇提取物进行化学成分的研究，从小果蔷薇中分离得到11个化合物，根据波谱数据结合理化性质确定各化合物的结构，分别鉴定为坡模酸（1）， 覆盆子酸（2）， 乌苏酸（3）， 蔷薇酸（4）， 阿江榄仁尼酸（5）， 委陵菜酸（6）， 3β-E-feruloyl corosolic acid（7）， 1β-羟基蔷薇酸（8）， 千花木酸（9）， 2，3-断-19α-羟基-12-稀-乌苏-2，3，28-三羧酸（10）， 冬青苷 B（11）。化合物3，6～8， 10， 11为首次从该植物中分离得到， 其中化合物7， 10为首次从蔷薇属分离得到。

[关键词] 小果蔷薇;蔷薇属;三萜类

小果蔷薇Rosa cymosa Tratt.系蔷薇科Rosaceae蔷薇属Rosa植物，《中国药典》附录收载金樱根药材为金樱子、小果蔷薇、粉团蔷薇三种植物的根 [1]，金樱根为大宗原料药材之一，是我国三金片、金鸡胶囊、妇科千金片、王老吉凉茶等著名中药产品的重要原料。小果蔷薇根始载于《生草药性备要》，又名山木香，小金樱等，在《本草纲目》、《植物名实图考》、《中国大辞典》有收载。它是暖温带至亚热带落叶或半常绿灌木，广泛分布在中国广西、广东、云南、贵州、江西、福建、台湾、江苏、浙江、安徽、湖南、四川等省区。小果蔷薇在民间作为一种有效的草药，具有祛风除湿、收涩固脱、解毒消肿的功效，主要用于风湿关节痛，跌打损伤，腹泻，治疗痈疖疮疡，烧烫伤等[2]。目前对小果蔷薇化学成分的研究报道较少，为进一步开发利用该植物资源，系统阐明金樱根物质基础，本研究对金樱根药材来源之一的小果蔷薇根的化学成分进行研究，从中分离得到11个化合物，分别鉴定为坡模酸（1）、覆盆子酸（2）、乌苏酸（3）、蔷薇酸（4）、阿江榄仁尼酸（5）、委陵菜酸（6）、3β-E-feruloyl corosolic acid（7）、1β-羟基蔷薇酸（8）、千花木酸（9）、2，3-断-19α-羟基-12-稀-乌苏-2，3，28-三羧酸（10）、冬青苷 B（11）。化合物7， 10为首次从蔷薇属分离得到，其中化合物3， 6～8， 10， 11为首次从该植物中分离得到。

1 材料

Bruker Avance Ⅲ 600型核磁共振波谱仪（德国Bruker公司），Lumtech 高效液相色谱仪（*K501四元低压半制备），Bylabuv-Ⅲ灯（北京炳洋科技有限公司），薄层色谱用硅胶（青岛海洋化工有限公司），柱色谱用硅胶（青岛海洋化工有限公司），ODS gel （40～60 μm， Daiso Co， Ltd， Japan），普通色谱用试剂均为分析纯（中国医药集团上海化学试剂公司），HPLC试剂均为色谱纯，蒸馏水为实验室自制。

药材由桂林三金药业股份有限公司提供，产地为桂林雁山镇，经广西壮族自治区民族医药研究院戴斌研究员鉴定为蔷薇科蔷薇属植物小果蔷薇R. cymosa根。

2 提取与分离

小果蔷薇根10.0 kg，阴干，粉碎，以70%乙醇加热回流提取3次，过滤，提取液减压回收乙醇，并浓缩至无醇味，所得流浸膏分散于水中，依次石油醚、乙酸乙酯萃取，萃取液分别回收溶媒，浸膏分别另存。水相经D101大孔树脂吸附，依次用水，35%乙醇， 55%乙醇， 75%乙醇和95%乙醇洗脱，洗脱液分别浓缩至干。

取95%乙醇洗脱部位（7 g），经硅胶柱（100～200目，100 g）柱色谱分离，分别用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、甲醇洗脱，浓缩得到5个部位Fr.1～5。Fr.2（0.5 g）用硅胶柱（100～200目） 柱色谱分离，石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱得到4个组分（Fr.2-1～ Fr.2-4）。Fr.2-4（43 mg）经HPLC半制备色谱分离（Agilent SB-Phenyl，9.4 mm×250 mm，5 μm，80%甲醇）得到化合物1（7.2 mg），2（12.1 mg）。Fr.3（2 g）用硅胶柱（100～200目）柱色谱分离，二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，薄层色谱检测，合并相似洗脱液得到4个组分（Fr.3-1～ Fr.3-4）。Fr.3-2（0.2 g）经硅胶（100～200目）柱色谱分离，氯仿-甲醇（80∶1）洗脱得到化合物3（20.2 mg）。Fr.3-3（0.1 g）先后经硅胶（100～200目）柱色谱分离，氯仿-甲醇梯度洗脱，HPLC半制备色谱分离（Agilent SB-Phenyl，9.4 mm×250 mm，5 μm，75%甲醇）得到化合物4（30 mg）。Fr.3-4（0.2 g）先后经硅胶（100～200目）柱色谱分离，氯仿-甲醇梯度洗脱，HPLC半制备色谱分离（Agilent SB-Phenyl，9.4 mm×250 mm，5 μm，80%，75%甲醇）得到化合物5（6.4 mg），6（20 mg），7（3.0 mg），8（2.0 mg）。Fr.4（2.3 g）经中压ODS柱30%，50%，70%，80%，100%甲醇洗脱，得到5个组分（Fr.4 -1～Fr.4-5）。Fr.4-3（30 mg）经HPLC半制备色谱分离（Agilent SB-Phenyl，9.4 mm×250 mm，5 μm，73%甲醇）得到化合物9 （3.0 mg），10 （8.5 mg）。Fr.4-4（50 mg）经HPLC半制备色谱分离Agilent SB-Phenyl（9.4 mm×250 mm， 5 μm）， 73%甲醇洗脱，得到化合物11（6.7 mg）。

3 结构鉴定

化合物1 白色粉末，10%浓硫酸-乙醇溶液显紫红色。1H-NMR（pyridine-d5，600 MHz）δ：3.43（1H，dd，J=12.0，6.0 Hz，H-3），5.61（1H，br s，H-12），3.02（1H，s，H-18），3.14（1H，dt，J=13.2，4.2 Hz，H-16），1.73（3H，s，27-CH3），1.45（3H，s，29-CH3），1.23（3H，s，23-CH3），1.11（3H，s，26-CH3），1.11（3H，d，J=6.6 Hz，30-CH3），1.02（3H，s，24-CH3），0.90（3H，s，25-CH3）。13C-NMR（pyridine-d5，150 MHz）数据见表1。以上数据与文献报道的pomolic acid基本一致[3]，故鉴定该化合物为坡模酸（pomolic acid）。

化合物2 白色粉末，10%浓硫酸-乙醇溶液显紫红色。1H-NMR（pyridine-d5，600 MHz）δ：5.60（1H，br s，H-12），3.10（1H，s，H-18），6.57（1H，s，H-1），1.68（3H，s，27-CH3），1.45（3H，s，29-CH3），1.24（3H，s，23-CH3），1.13（3H，s，25-CH3），1.12（3H，s，26-CH3），1.12（3H，d，J=6.0 Hz，30-CH3），1.11（3H，s，24-CH3）。13C-NMR（pyridine-d5，150 MHz）数据见表1。以上数据与文献报道的fupenzic acid基本一致[4]，故鉴定该化合物为覆盆子酸（fupenzic acid）。

化合物3 白色粉末，10%浓硫酸-乙醇溶液显紫红色。1H-NMR（pyridine-d5，600 MHz）δ：3.45（1H，dd，J=10.8，6.0 Hz，H-3），5.45（1H，br s，H-12），2.63（1H，d，J=11.4 Hz，H-18），1.24（3H，s，26-CH3），1.22（3H，s，23-CH3），1.05（3H，s，27-CH3），1.02（3H，s，25-CH3），1.00（3H，d，J=6.6 Hz，30-CH3），0.95（3H，d，J=6.0 Hz，29-CH3），0.88（3H，s，24-CH3）。13C-NMR（pyridine-d5，150 MHz）数据见表1。以上数据与文献报道的ursolic acid基本一致[5]，故鉴定该化合物为乌苏酸（ursolic acid）。

化合物4 白色粉末，10%浓硫酸-乙醇溶液显紫红色。1H-NMR（pyridine-d5，600 MHz）δ：3.75（1H，d，J=2.4 Hz，H-3β），4.29（1H， dt，J=7.2，3.6 Hz，H-2），5.57（1H，br s，H-12），3.03（1H，s，H-18）， 2.32（1H，td，J=13.8，4.8 Hz，H-15），1.88（1H，dd，J=12.0，4.2 Hz，H-1），1.63（3H，s，27-CH3），1.40（3H，s，29-CH3），1.25（3H，s，23-CH3），1.10（3H，d，J=4.8 Hz，30-CH3），1.10（3H，s，26-CH3），0.97（3H，s，25-CH3），0.89（3H，s，24-CH3），。13C-NMR（pyridine-d5，150 MHz）数据见表1。以上数据与文献报道的euscaphic acid基本一致[3]，故鉴定该化合物为2α，3α，19α-三羟基乌苏-12-稀-28-酸，即蔷薇酸（euscaphic acid）。

化合物5 白色粉末，10%浓硫酸-乙醇溶液显紫红色。1H-NMR（pyridine-d5，600 MHz）δ：3.38（1H，d，J=9.6 Hz，H-3），4.10（1H，td，J=10.8，4.2

表1 化合物1～11的碳谱数据（pyridine-d5，150 MHz）

Table 1 13C-NMR data of compounds 1-11

No.1234567891011

139.5129.937.943.347.948.448.581.342.747.440.0

228.6146.628.666.669.069.166.871.866.7174.827.4

378.7201.578.679.884.284.385.580.179.4182.889.2

439.845.139.539.039.140.340.238.843.140.940.0

556.354.656.349.256.456.456.348.948.240.056.4

619.419.619.219.119.419.419.119.218.943.319.1

734.133.734.034.033.734.033.834.233.733.534.0

840.838.840.441.040.540.940.441.641.043.440.8

948.343.748.548.148.848.348.449.144.049.448.2

1037.841.337.739.140.339.038.744.238.938.937.4

1124.524.423.024.524.724.624.128.424.622.524.4

12128.5128.0126.1128.5124.4128.4125.8129.9128.4129.0128.5

13140.4140.7139.7140.4145.3140.4139.8139.2140.4140.1140.4

1442.642.943.042.642.642.643.042.542.342.842.5

1529.829.629.129.729.529.729.128.429.727.429.8

1626.926.824.126.828.826.925.326.826.824.927.2

1748.848.748.048.746.548.749.048.748.748.848.7

1855.155.254.055.145.255.153.954.955.055.155.0

1973.273.139.973.281.673.239.973.073.173.273.1

2042.842.839.842.836.142.839.842.742.842.842.8

2127.427.331.627.429.627.431.527.327.427.026.8

2238.939.039.839.334.038.937.938.938.929.939.2

2329.228.229.229.929.729.829.429.871.728.028.7

2416.922.517.022.718.017.217.322.717.424.717.2

2516.020.416.117.117.217.317.813.417.817.116.0

2617.217.917.917.717.918.117.918.018.220.017.6

2725.125.124.325.1025.225.124.425.125.125.425.1

28181.1181.0180.3181.2181.3181.1180.3181.1181.1181.1181.1

2927.627.418.027.529.227.618.727.427.527.627.6

3017.717.121.817.225.217.721.817.217.217.717.4

1′127.1108.1

2′111.876.0

3′149.379.1

4′148.171.7

5′117.267.6

6′125.8

7′145.8

8′116.7

9′168.3

OMe56.0

Hz，H-2），5.55（1H，br s，H-12），3.60（1H，d，J=5.4 Hz，H-19），1.63（3H，s，27-CH3），1.26（3H，s，23-CH3），1.18（3H，s，29-CH3），1.10（3H，s，30-CH3），1.08（3H，s，24-CH3），1.06（3H，s，25-CH3），1.01（3H，s，26-CH3）。13C-NMR（pyridine-d5，150 MHz）数据见表1。以上数据与文献报道的arjunic acid基本一致[6]，故鉴定该化合物为阿江榄仁尼酸（arjunic acid）。

化合物6 白色粉末，10%浓硫酸-乙醇溶液显紫红色。1H-NMR（pyridine-d5，600 MHz）δ：3.38（1H，d，J=9.0 Hz，H-3），4.10（1H，dt，J=11.4，4.8 Hz，H-2），5.57（1H，br s，H-12），3.04（1H，s，H-18），1.70（3H，s，27-CH3），1.42（3H，s，29-CH3），1.26（3H，s，23-CH3），1.10（3H，s，26-CH3），1.07（3H，s，24-CH3），1.00（3H，s，25-CH3），1.11（3H，d，J=7.2 Hz，30-CH3）。13C-NMR（pyridine-d5，150 MHz）数据见表1。以上数据与文献报道的tomentic acid基本一致[5]，故鉴定该化合物为委陵菜酸（tomentic acid）。

化合物7 白色粉末，10%浓硫酸-乙醇溶液显紫红色。1H-NMR（pyridine-d5，600 MHz）δ：5.26（1H，d，J=9.6 Hz，H-3），4.30（1H，td，J=10.2，4.2 Hz，H-2），5.50（1H，br s，H-12），2.63（1H，d，J=11.4 Hz，H-18），3.77（3H，s，OMe）， 8.00（1H，d，J=15.6 Hz，H-7′），7.27（1H，s，H-6′），7.20（1H，s，H-2′），6.72（1H，d，J=15.6 Hz，H-8′）， 1.22（3H，s，27-CH3），1.07（3H，s，23-CH3），1.04（3H，s，25-CH3），1.02（3H，s，26-CH3），0.99（3H，d，J=7.2 Hz，30-CH3），0.95（3H，d，J=6.0 Hz，29-CH3）。13C-NMR（pyridine-d5，150 MHz）数据见表1。以上数据与文献报道的3β-E-feruloyl corosolic acid基本一致[7-9]，故鉴定该化合物为3β-E-feruloyl corosolic acid。

化合物8 白色粉末，10%浓硫酸-乙醇溶液显紫红色。1H-NMR（pyridine-d5，600 MHz）δ：4.11（1H，d，J=9.6 Hz，H-1），3.85（1H，d，J=2.4 Hz，H-3），5.69（1H，br s，H-12），3.04（1H，s，H-18），1.67（3H，s，27-CH3），1.40（3H，s，29-CH3），1.26（3H，s，23-CH3），1.24（3H，s，26-CH3），1.21（3H，s，25-CH3），1.10（3H，d，J=6.6 Hz，30-CH3），0.93（3H，s，24-CH3）。13C-NMR（pyridine-d5，150 MHz）数据见表1。以上数据与文献报道的1β-hydroxyeuscaphic acid基本一致[10]，故鉴定该化合物1β-羟基蔷薇酸（1β-hydroxyeuscaphic acid）。

化合物9 白色粉末，10%浓硫酸-乙醇溶液显紫红色。1H-NMR（pyridine-d5，600 MHz）δ：4.27（1H，br d，J=10.8 Hz，H-2），4.13（1H，br s，H-3），5.58（1H，br s，H-12），3.03（1H，s，H-18），3.74（1H，d，J=10.8 Hz，H-23a），3.91（1H，d，J=10.8 Hz，H-23b），1.66（3H，s，27-CH3），1.40（3H，s，29-CH3），1.12（3H，s，26-CH3），1.01（3H，s，25-CH3），1.09（3H，d，J=6.6 Hz，30-CH3），0.85（3H，s，24-CH3）。13C-NMR（pyridine-d5，150 MHz）数据见表1。以上数据与文献报道的myrianthic acid基本一致[11]，故确定该化合物为千花木酸（myrianthic acid）。

1 材料

1.1 仪器

Agilent1100高效液相色谱仪（Agilent Technologies公司，配有在线脱气机、四元泵和二极管阵列检测器）;Esquire-LC质谱仪（德国Bruker Daltonik GmbH公司）;KQ-300CDE型数控超声波发生器（昆山市超声仪器有限公司）;电子天平AG135（Mettler Toledo公司）。

1.2 药品与试剂

穿心莲二萜内酯有效部位[河南大学药物研究所提供，批号200120829），其中穿心莲内酯40.1%，脱水穿心莲内酯11.8%];穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯（成都天台山制药）;色谱纯乙腈（天津四友生物医学技术有限公司）;注射用生理盐水（山东鲁抗辰欣药业）;水为二次蒸馏水。

1.3 实验动物

昆明小鼠，雌性，体重（20±2） g，河南省实验动物中心购买，试验前1周于本实验室饲养，进行环境适应;C57BL/6小鼠，北京维通利华动物中心购买。

1.4 细胞株

鼠源性肝癌H22细胞，河南大学药物研究所保存，正常复苏后于昆明小鼠腹腔接种传代;鼠源肺癌Lewis细胞，河南大学药物研究所保存，正常复苏后于C57BL/6小鼠接种传代。

2 方法与结果

2.1 液质联用技术鉴定其主要化学成分

2.1.1 色谱条件

液相条件：色谱柱为Agilent SB-C18 （2.1 mm×150 mm， 5 μm）;流动相A为乙腈，流动相B为水，60 min梯度洗脱A-B（10∶90～35∶65）;流速0.4 mL・min-1;进样 5 μL;检测波长 205 nm。柱温 25 ℃。

质谱条件：电喷雾电离（ESI），检测离子为正离子;喷雾氮气流速2.5 L・min-1;采用质谱扫描方式，m/z范围50～1 000;扫描间隔1 s;分辨率为0.25 nmu，信噪比S/N=25∶1。

2.1.2 检测波长的选择

穿心莲二萜内酯有效部位中主要含有二萜内酯类有效成分，二萜类的成分在紫外末端均有吸收，本实验检测波长选择205 nm。

2.1.3 对照品混合溶液的制备

精密称定对照品穿心莲内酯8.2 mg和脱水穿心莲内酯2.2 mg，加入10 mL的量瓶中，加入适量10%乙腈水溶液，室温下超声溶解0.5 h，放冷，用10%乙腈水溶液定容至刻度，0.45 μm的微孔滤膜过滤，取续滤液，即得对照品溶液。

2.1.4 供试品溶液的制备

取20 mg干燥过的穿心莲二萜内酯有效部位，加入10 mL的量瓶中，加入适量10%乙腈水溶液，室温下超声溶解0.5 h，放冷，用10%乙腈水溶液定容至刻度，0.45 μm的微孔滤膜过滤，取续滤液，即得供试品溶液。

2.1.5 穿心莲二萜内酯有效部位液质联用分析

取样品溶液进行HPLC-DAD-ESI-MS分析，见图1，有效部位主要含有5个色谱峰，其中保留时间为28.9 min的1号峰响应值最高，保留时间为51.8 min的5号峰响应值次之，在相同色谱条件下，取对照品穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯混合溶液进样分析比较发现，见图2，1号峰为穿心莲内酯，5号峰为脱水穿心莲内酯，为进一步鉴别各组分，对正离子模式下的质谱进行分析，结果显示，穿心莲二萜内酯有效部位中各个主要成分在正离子下均有较好的响应。

图1 总离子流色谱图（A）及液相色谱图（B）

Fig.1 Total ion chromatography and liquid chromatography of plans

1. 穿心莲内酯，5. 脱水穿心莲内酯。

图2 混合对照品溶液HPLC图

Fig.2 HPLC chromatogram of mixed reference substances

2.1.6 穿心莲二萜内酯有效部位主要化学成分的鉴定

采用HPLC-DAD-ESI-MS联用技术，可以获得每一个色谱峰所对应化合物的正离子模式下的质谱信息，进而获知该化合物的相对分子质量的质荷比、结合部分对照品及质谱规律分析，推测主要色谱峰的化合物归属。

二萜内酯类成分是穿心莲的特征性成分，更是穿心莲二萜内酯有效部位的特征性主要成分，在色谱图中响应较好，化合物1～5均为二萜内酯类成分，在质谱中响应较好，这几个化合物由于母核结构较相近，因此难以对其进行定性区分，通过与文献中报道的穿心莲二萜内酯类成分相对分子量进行对比，结合对照品对照，初步鉴定了这5个二萜内酯类成分，见表1。

根据总离子流色谱图（TIC）、提取质谱图及相关文献[8，10-11]，对主要色谱峰进行初步归属。

表1 穿心莲二萜内酯有效部位中主要化合物的鉴定

Table 1 Identification of main components in diterpene lactone effective part of Andrographis panniculata

峰号tR/minm/z化合物离子归属

M+HM+NaM+H-H2OM+H-2H2OM+H-3H2OM+H-GluM+H-Glu-H2O

128.9350穿心莲内酯351.3373.1333.1315.1297.2

232.6350异穿心莲内酯351.1373.1333.1315.1297.2

348.5480新穿心莲内酯503.1319.1301.3

450.433414-去氧穿心莲内酯335.1357.1317.1299.1

551.8332脱水穿心莲内酯333.1355.1315.1297.2

HPLC-DAD对照试验表明，tR 28.9 min（TIC图中的1号色谱峰）的色谱峰为穿心莲内酯，相对分子质量为350，提取质谱图表现为：m/z 351.3[M+H]+，373.1[M+Na]+，389.1[M+K]+等特征峰，333.1[M+H-H2O]+，315.1[M+H-2H2O]+，297.2[M+H-3H2O]+ 等脱水峰，及m/z 701.3[2M+H]+，723.4[2M+Na]+ 峰;tR 32.6 min（TIC图中的2号峰）表现为m/z 351.3[M+H]+，373.1[M+Na]+ 特征峰，333.1[M+H-H2O]+，315.1[M+H-2H2O]+，297.2[M+H-3H2O]+等脱水峰及m/z 701.4[2M+H]+，723.4[2M+Na]+ 等峰，通过比对质谱数据我们1号和2号峰相对分子质量相同，推测其可能为异穿心莲内酯。它是穿心莲内酯的同分异构体;tR 48.5 min（TIC图中的3号峰）表现为m/z 503.1[M+Na]+ 特征峰、及m/z 319.1[M+H-Glu]+，301.3[M+H-Glu-H2O]+等脱糖基峰，推测其可能为新穿心莲内酯;tR 50.4 min（TIC图中的4号峰）表现为m/z 335.1[M+H]+，357.1[M+Na]+特征峰，317.1[M+H-H2O]+，299.1[M+H-2H2O]+ 等脱水峰及m/z 699.4[2M+H]+，691.3[2M+Na]+等峰，推测其可能为14去氧穿心莲内酯;tR 51.8 min（TIC图中的5号峰）表现为m/z 333.1[M+H]+，355.1[M+Na]+特征峰，315.1[M+H-H2O]+，297.2[M+H-2H2O]+ 等脱水峰及m/z 665.3[2M+H]+，687.4[2M+Na]+ 等峰，参照对照后，推测其为脱水穿心莲内酯。

2.1.7 穿心莲二萜内酯有效部位质谱规律分析

分析穿心莲二萜内酯有效部位的HPLC-DAD-ESI-MS质谱数据可以发现：在正离子模式下，二萜内酯苷元类成分均出现了[M+H]+，[M+Na]+等特征峰和脱去不同水分子的脱水峰，在坐标轴较大的位置还出现了[2M+H]+及[2M+Na]+ 峰。而二萜内酯苷类成分新穿心莲内酯，则出现了[M+Na]+特征峰和[M+H-Glu]+，[M+H-Glu-H2O]+ 等脱糖基峰，这些质谱规律对于穿心莲二萜内酯类成分的液质分析具有较好的参考价值。

2.2 抗肿瘤方面初步药效学研究

2.2.1 穿心莲二萜内酯有效部位对H22肝癌皮下瘤模型生长的影响

2.2.1.1 H22肝癌皮下瘤接种 将H22肝癌细胞复苏后，接种于准备好的昆明小鼠腹腔内，培养8～10 d，取生长良好的小鼠腹水（颜色呈乳白色），取生理盐水以约1∶2稀释，目标细胞浓度约为1×107个/mL，然后以0.2 mL/只接种于昆明小鼠腋窝皮下，即得昆明小鼠肿瘤模型。

2.2.1.2 肿瘤模型的分组与给药 将昆明小鼠肿瘤模型按体重分为5组，每组15只小鼠。第1组：空白对照模型组，试验中给予相同体积生理盐水灌胃;第2组：穿心莲内酯组给药量为450 mg・kg-1;第3～5组：穿心莲二萜内酯有效部位分为低、中、高剂量3组，给药剂量分别为300， 450， 600 mg・kg-1。每组均于肿瘤模型接种后第2天开始给药，药物均使用0.5%羧甲基纤维素钠制成药物混悬液，灌胃剂量为0.01 mL・g-1，每日1次，连续给药10 d。给药结束后第2天，处死实验小鼠取出肿瘤并称取重量，按以下公式计算出抑瘤率。

抑瘤率=（空白对照组肿瘤质量平均值-用药组肿瘤重量平均值）/空白对照组肿瘤质量平均值×100%

同时取出动物模型的脾脏和胸腺，按下述公式计算即可得出脾脏指数及胸腺指数。

脾脏指数=脾脏质量/小鼠模型体重×100%

胸腺指数=胸腺质量/小鼠模型体重×100%

2.2.1.3 有效部位对H22肝癌皮下瘤的抑制作用 每组小鼠模型均在接种腹水后第3～5天内出现可以触及的肿瘤结节，并呈现进行性增大。实验过程中没有肿瘤消退现象，发现个别小鼠死亡后，立即进行解剖观察，并未发现肉眼可见的病理性改变。本组试验结果表明：穿心莲二萜内酯有效部位对H22肝癌模型实体瘤的生长具有较为显著的抑制性作用，见表2。

表2 对小鼠肝癌皮下瘤的生长抑制作用结果 （±s，n=10）

Table 2 The growth inhibition of mouse hepatocellular subcutaneous carcinoma （±s，n=10）

组别剂量/mg・kg-1脾脏指数胸腺指数瘤重/g抑瘤率/%

空白对照8.66±2.431.83±1.194.02±2.35

穿心莲内酯4509.41±1.432.01±1.242.43±1.132）39.55

有效部位13008.28±2.721.58±1.112.21±1.012）45.02

有效部位24507.01±1.261.73±1.032.11±0.832）47.51

有效部位36008.01±1.691.36±0.592.02±0.762）49.75

注：与空白对照组相比 1）P<0.05，2）P<0.01（表3同）。

2.2.2 穿心莲二萜内酯有效部位对Lewis肺癌皮下瘤模型生长的影响

2.2.2.1 Lewis肺癌皮下瘤接种 将Lewis肺癌细胞复苏后，接种于准备好的C57BL/6小鼠腋下，培养10～15 d，取生长良好的小鼠腋下瘤块，放入匀浆器中，加少量生理盐水进行充分研磨匀浆，离心后加生理盐水稀释到细胞浓度约为1×107个/mL，然后以0.2 mL/只接种于C57BL/6小鼠腋窝皮下，即得C57BL/6小鼠肿瘤模型。

[9] 韩光， 许启泰， 刘蕾. 穿心莲超分子提取物、其制备方法及用途：中国，ZL 200510017655.0[P]. 2005-11-16.

[10] 张尊建， 黄海娟， 余静. 穿心莲药材的色谱指纹图谱[J]. 中国天然药物， 2005， 3（6）：373.

[11] 陈丽霞， 曲戈霞， 邱峰. 穿心莲二萜内酯类化学成分的研究[J].中国中药杂志， 2006， 31（19）：1594.

Identification of main chemical constituents of diterpene lactone effective

fraction of Andrographis panniculataby HPLC-DAD/

ESI-MS and their preliminary pharmacodynamics research

LI Jing-hua1.2， XU Xiao-xiao3， ZHAO Yan-cong4， HAN Guang1*

（1. Pharmaceutical Institute of He′nan University， Kaifeng 475004， China;

2.Key Lab of Natural Medicine and Immunal Engineering， Henan University， Kaifeng 475004， China;

3. Dengzhou center hospital， Nanyang 474150， China; 4. The First Affiliated Hospital of He′nan University， Kaifeng 475001， China）

[Abstract] Objective： To establish an HPLC-DAD/ESI-MS method for quickly identifying chemical constituents in diterpene lactone effective fraction of Andrographis panniculata and to study its pharmacodynamics. Method： The separation was performed on an Agilent SB-C18 column （2.1 mm×150 mm， 5 μm） with a mobile phase of acetonitrile （A） and water（B）. The flow rate was maintained at 0.4 mL・min-1 and detection wavelength was set at 205 nm. The samples were analyzed in positive ion mode， and mass scan range was m/z 50-1 000. Using two kinds of tumor cell lines made living animal models， and studied preliminary pharmacodynamics on anti-tumor aspect. Result： Five diterpene lactones in the diterpene lactone effective fraction of A. panniculata could be separated in one run. Pharmacodynamic experiments showed that the effectve fraction had an inhibitory effect on the growth of tumor. Conclusion： A rapid and efficient HPLC-ESI-MS method to determine the chemical constituents in diterpene lactone effective fraction of A. panniculata has been established， and the preliminary pharmacodynamics research has been done， which could be used for the quality control and further studies of diterpene lactone effective fraction of A. panniculata in vivo.

[Key words] HPLC-DAD/ESI-MS; diterpene lactone effective part of Andrographis panniculata; chemical constituents; Pharmacodynamics study

doi：10.4268/cjcmm20142331